周晴晴，閆紅霞，孫 蕾，劉喜龍，李 黎，汲 翔，高艷鋒，汲振余，祁元明，康巧珍#

1)鄭州大學生物工程系鄭州 450001 2)鄭州大學基礎醫(yī)學院鄭州 450001 3)河南省醫(yī)藥科學研究院鄭州450052 #通訊作者，女，1965年4月生，博士，教授，研究方向:蛋白4.1與腫瘤，E-mail:qzkang@zzu.edu.cn

蛋白4.1R基因敲除小鼠的引種及繁殖*

周晴晴1)，閆紅霞1)，孫 蕾1)，劉喜龍1)，李 黎1)，汲 翔2)，高艷鋒1)，汲振余3)，祁元明1)，康巧珍1)#

1)鄭州大學生物工程系鄭州 450001 2)鄭州大學基礎醫(yī)學院鄭州 450001 3)河南省醫(yī)藥科學研究院鄭州450052 #通訊作者，女，1965年4月生，博士，教授，研究方向:蛋白4.1與腫瘤，E-mail:qzkang@zzu.edu.cn

基因敲除小鼠;蛋白4.1R

目的:引種、繁殖4.1R基因敲除小鼠，用于蛋白4.1R功能的研究。方法:按照國家進出境動物檢驗檢疫的具體要求，對引種自美國的3對4.1R基因敲除小鼠進行隔離、檢疫。引進的種鼠按照SPF動物飼養(yǎng)標準操作規(guī)程在IVC屏障系統(tǒng)中進行1雄1雌長期同居方式繁殖，C57BL/6J對照組小鼠采用同樣方式飼養(yǎng)繁殖。定期觀察記錄種鼠的繁殖率、仔鼠出生率及成活率。比較基因敲除小鼠與野生型小鼠體質(zhì)量變化。提取仔鼠尾組織基因組DNA，用PCR法進行基因型鑒定。結果:經(jīng)隔離檢疫，3對4.1R敲除小鼠符合我國SPF小鼠的微生物控制級別。23只繁殖仔鼠基因型PCR鑒定結果為基因敲除純合子，雌鼠產(chǎn)仔率100%，平均胎產(chǎn)仔5.8只，仔鼠成活率74%?；蚯贸∈笃骄w質(zhì)量與野生型小鼠比較差異無統(tǒng)計學意義(F組間=4.035，P=0.056;F時間=543.723，P＜0.001;F交互=4.358，P=0.004)。結論:在國內(nèi)成功引種和繁殖C57BL/6J-4.1R－/－小鼠。

蛋白4.1R最初是在成熟紅細胞中發(fā)現(xiàn)的相對分子質(zhì)量為80 000的細胞膜骨架蛋白成分，對維持紅細胞的正常形態(tài)和生理功能十分重要［1-3］。近年來研究［4-5］發(fā)現(xiàn)蛋白4.1R及其家族成員在紅細胞以外的組織中廣泛表達，但人們對蛋白4.1R及其家族成員在有核細胞中的功能卻了解甚少。為在動物整體水平了解蛋白4.1R功能，鄭州大學生物工程系于2010年3月引種4.1R基因敲除小鼠，現(xiàn)將引種及繁殖情況報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57BL/6J-4.1R－/－小鼠由美國紐約血液中心紅細胞生理實驗室安秀麗博士惠贈，3雄3雌，6周齡，品系為C57BL/6J，基因背景為4.1R基因敲除純合子(4.1R－/－);野生型C57BL/6J小鼠，購自中國醫(yī)學科學院血液學研究所實驗動物中心，許可證號SCXK(津)2004-0001，SPF級，雌雄各半，共8只，6周齡。

1.2 小鼠的隔離與檢疫 按照《中華人民共和國法典》進出境動物臨時隔離檢疫場管理辦法要求建立臨時隔離場，申請驗收，獲批準后，對引種動物進行為期30 d的隔離檢疫。

1.3 小鼠的飼養(yǎng)條件 將小鼠按照SPF實驗動物標準操作規(guī)程置于動物實驗室IVC-Ⅱ型獨立送風隔離籠具內(nèi)(蘇州馮氏實驗動物設備有限公司產(chǎn)品)，室內(nèi)溫度控制在18～22℃，濕度50%～60%，照明為12 h亮12 h暗交替進行。飼料為河南省實驗動物中心配制的近交系小鼠全價顆粒飼料，食物經(jīng)60Co照射處理。小鼠籠盒、墊料以及飲水經(jīng)高溫高壓滅菌處理。飼養(yǎng)過程中，墊料每周更換1次，食水定期補充，自由攝取。

1.4 小鼠的繁殖方式 C57BL/6J-4.1R－/－小鼠繁殖采用1只雄鼠與1只雌鼠長期同居的方式進行。記錄種鼠產(chǎn)仔率及仔鼠成活率。野生型C57BL/6J小鼠作為對照，采取同樣的方式繁殖。

1.5 動物觀察 每天上午9:00至下午4:00進入飼養(yǎng)室觀察動物進食、飲水及活動情況。按常規(guī)方法記錄環(huán)境因素、小鼠健康及生長繁育情況。

1.6 仔鼠體質(zhì)量稱量 分娩第2天稱量仔鼠體質(zhì)量并記為哺乳零周平均體質(zhì)量，每周定時稱量并計算出1周的平均體質(zhì)量，從哺乳零周測至6周齡，繪制動物的生長曲線。

1.7 小鼠的基因鑒定 參照Qiagen公司組織基因組DNA提取試劑盒進行。將小鼠尾部組織(長0.5～1.0 cm)置入1.5 mL Eppendoff管中，然后加入含蛋白酶K(20 g/L)的T Buffer 200 μL，在55℃水浴槽中過夜，離心后將上清液移入新的Eppendorf管內(nèi)，加入15 μL RNase A(25 g/L)以去除RNA;加入410 μL預混的Buffer BL(200 μL BL+210 μL乙醇)和等體積的異丙醇，劇烈振蕩;將全部反應液轉(zhuǎn)移到DNA結合柱上，8 000 g離心1 min;用750 μL洗滌Buffer 8 000 g離心1 min，洗柱2遍后以最大離心力(12 000 g)離心1 min;將柱子置于1個新的1.5 mL Eppendorf管中，加入200 μL預熱的DNA洗脫Buffer，8 000 g離心1 min。吸取4 μL含鼠基因組DNA的溶液，加入94 μL的ddH2O，將以上DNA模板液1.5 μL加入25 μL的PCR反應體系進行PCR擴增。Exon4上游引物序列:5’-GCTCAG GAAGAACACAGAGAGG-3’，下游引物序列:5’-CATTCGTAGACCGTGTCATCC-3’，擴增產(chǎn)物大小200 bp;Neo上游引物序列:5’-GATGGATTGCACG CAGGT-3’，下游引物序列:5’-GGCAGGAGCAAG GTGAGA-3’，擴增產(chǎn)物大小230 bp。PCR反應體系:25 μL反應體系中含引物(20 μmol/L)2 μL，MgCl2(50 mmol/L)2.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP(20 mmol/L)1 μL，Taq聚合酶(2 U/μL)0.25 μL，DNA模板1.5 μL，加ddH2O補足25 μL。PCR擴增條件:95℃預變性30 s，94℃變性30 s;50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)。取5 μL PCR產(chǎn)物點樣于15 g/L瓊脂糖凝膠上進行電泳。擴增出1條197 bp條帶的為野生型，擴增出1條230 bp條帶的為4.1R基因敲除純合子小鼠，擴增出2條條帶的為雜合子對照小鼠(+/－)。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 12.0進行統(tǒng)計分析，應用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析比較 C57BL/6J-4.1R－/－與C57BL/6J仔鼠體質(zhì)量增長情況，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 隔離與檢疫結果 在隔離期，經(jīng)我國出入境檢驗檢疫局對引種C57BL/6J-4.1R－/－小鼠進行檢驗檢疫，結果合格，準予使用。微生物控制級別符合我國SPF小鼠的等級。

2.2 小鼠繁殖情況 3對種鼠均已產(chǎn)仔，雌鼠產(chǎn)仔率100%。4胎產(chǎn)仔共23只，平均胎產(chǎn)仔5.8只。成活17只，仔鼠成活率74%。

2.3 仔鼠生長情況 見表1。

表1 不同日齡2組仔鼠體質(zhì)量比較(n=13) g

2.4 小鼠的基因型鑒定結果 見圖1。4胎共23只繁殖仔鼠，PCR鑒定結果為基因敲除純合子。

圖1 小鼠基因型鑒定PCR凝膠電泳圖

3 討論

基因敲除是指通過同源重組原理，向小鼠胚胎干細胞(embryonic stem cell，ES)內(nèi)源基因引入特定的突變，使靶基因功能喪失。這種特定的突變可通過生殖系傳遞下去。自1990年起，發(fā)達國家十分重視基因敲除小鼠技術。一旦某種人類疾病基因被克隆成功，便可制備相應的基因敲除小鼠，從而對該基因的功能和作用途徑進行研究。目前許多基因敲除小鼠被用作人類疾病模型。我國先后從國外引進和制備了多種基因敲除小鼠，并對其引種、保種、繁殖特性、基因型鑒定及遺傳穩(wěn)定性等進行了研究［6-7］。蛋白4.1R是將紅細胞跨膜蛋白和血影蛋白-肌動蛋白骨架網(wǎng)絡連接起來的橋梁，對維持紅細胞的形狀、黏附、脆性及正常生理功能發(fā)揮重要作用。人類蛋白4.1R表達缺失會導致溶血性貧血［2］。研究［8］發(fā)現(xiàn)細胞骨架蛋白4.1R在CD4+T細胞中與免疫突觸的形成有關。

C57BL/6J-4.1R－/－小鼠成功引進后，按照SPF級動物飼養(yǎng)標準進行飼養(yǎng)繁殖。對子1代小鼠進行基因型和表型鑒定，目前已繁殖4.1R基因敲除純化子小鼠23只。4.1R基因敲除小鼠引種成功不僅為研究4.1R對CD4+T細胞免疫應答的調(diào)控提供模型，還將為今后研究蛋白4.1R在紅細胞發(fā)育中的功能及相關疾病研究提供有效的動物模型。

［1］ Diakowski W，Grzybek M，Sikorski AF.Protein 4.1，a component of the erythrocyte membrane skeleton and its related homologue proteins forming the protein 4.1/FERM superfamily［J］.Folia Histochem Cytobiol，2006，44(4):231

［2］Salomao M，Zhang X，Yang Y，et al.Protein 4.1R-dependent multiprotein complex:new insights into the structural organization of the red blood cell membrane［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(23):8026

［3］Cannon JL.4.1R:a FERM player at the immunologic synapse［J］.Blood，2009，113(24):6043

［4］時曉芳，閆紅霞，宋安營，等.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-4.1N乳癌細胞系的篩選與鑒定［J］.鄭州大學學報:醫(yī)學版，2010，45(4):551

［5］高艷鋒，翟明霞，宋英，等.肺小細胞癌組織中4.1蛋白家族的表達［J］.鄭州大學學報:醫(yī)學版，2008，43(4):651

［6］杜智勇，粟永萍.SRC-3基因敲除小鼠的飼養(yǎng)繁殖及鑒定［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2005，27(5):373

［7］趙玲，杜曉蘭，蘇楠，等.HIF-1α條件性基因敲除嵌合體小鼠的獲得［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2007，29(14):1361

［8］Kang Q，Yu Y，Pei X，et al.Cytoskeletal protein 4.1R negatively regulates T-cell activation by inhibiting the phosphorylation of LAT［J］.Blood，2009，113(24):6128

Introducing and breeding of protein 4.1R gene knock out mice

ZHOU Qingqing1)，YAN Hongxia1)，SUN Lei1)，LIU Xilong1)，LI Li1)，JI Xiang2)，GAO Yanfeng1)，JI Zhenyu3)，QI Yuanming1)，KANG Qiaozhen1)1)Department of Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001 2)College of Basic Medical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001 3)Henan Academy of Medical and Pharmaceutical Sciences，Zhengzhou 450052

gene knock out mouse;protein 4.1R

Aim:To introduce and reproduce 4.1R gene knock out mouse for exploring the functions of protien 4.1R.Methods:A total of 3 pairs of 4.1R gene knock out mice introduced from the USA were isolated and inspected according to the Animal Inspection and Quarantine Law of PR China.The introduced 4.1R knock out mice were breeding in IVC equipment according to the SPF Laboratory Animal Standard Operation Procedure.A pair of one male and one female homozygote were used to reproduce 4.1R knock out mice and C57BL/6J mice were used as control.The body weights and the rate of femal reproduction，birth and survival between gene konck out and wild type mice were recorded regularly for further analysis.The genomic DNA from the murine tail tissue was subjected to PCR for genotyping.Results:The inspection and quarantine results showed that the introduced 4.1R knock out mice were qualified for the SPF laboratory mouse grade of China.PCR results showed that 23 reproduced mice were 4.1R gene knock out homozygotes.The average litter size was 5.8 and the survival rate was 74%.Though no significant difference of weight was found between wild type and 4.1R knock out mice(Fgroups=4.035，P=0.056;Ftime=543.723，P＜0.001;Finter=4.358，P=0.004).Conclusion:4.1R gene knock out mice has been introduced and reproduced successfully in China.

Q95-331

*國家自然科學基金資助項目 30972707，30873002;河南省科技創(chuàng)新杰出青年基金資助項目 104100510004

(2010-07-02收稿 責任編輯趙秋民)