吳文迅，陳香宇，王慶祝，秦貴軍#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科鄭州450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科鄭州450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科鄭州450052

(2010-06-23收稿 責(zé)任編輯 趙秋民)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病微血管病變的主要并發(fā)癥，其發(fā)生與糖尿病腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)活性增高有關(guān)，血管緊張素Ⅱ(Ang-Ⅱ)是RAS系統(tǒng)重要組成部分，Ang-Ⅱ等縮血管活性物質(zhì)是通過(guò)刺激細(xì)胞內(nèi)第二信使1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)的產(chǎn)生而發(fā)揮作用［1］。IP3受體(IP3 receptors，IP3R)可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣釋放和細(xì)胞外鈣內(nèi)流，從而引起腎血管收縮［2］，導(dǎo)致腎血流減少。研究表明，在心力衰竭［3］、心房顫動(dòng)［4］、心肌肥厚［5］、原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓［6］、血栓形成［7］以及腎臟病變［8-12］中Ⅰ型 IP3R水平升高。作者觀察Ⅰ型IP3R在DN模型大鼠腎臟組織中的表達(dá)，探討其在DN中的作用及機(jī)制，為治療DN提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑 健康雄性SD大鼠35只，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、兔抗大鼠IP3R即用型抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，尿蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，SP試劑盒和DAB試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，PCR引物購(gòu)自北京賽百盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物模型的制備及實(shí)驗(yàn)分組 DN組大鼠:以新鮮配制的枸櫞酸緩沖液(0.1 mol/L，pH=4.6)稀釋STZ至10 g/L，60 mg/kg腹腔注射進(jìn)行糖尿病造模，成功后隨機(jī)分為3組，普通飲食繼續(xù)喂養(yǎng)3、6及12周，收集24 h尿液，用放射免疫法測(cè)定24 h尿蛋白排泄量，24 h尿蛋白定量≥30 mg時(shí)確認(rèn)模型成功。獲得DN 3周組(n=9)、DN 6周組(n=8)、DN 12周組(n=8)3組動(dòng)物。正常對(duì)照組(n=10)大鼠腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液。斷頭處死后，取右腎組織計(jì)算腎質(zhì)量指數(shù)(右腎質(zhì)量/總體質(zhì)量);左腎組織部分于體積分?jǐn)?shù)為40%甲醛液中固定，制備石蠟標(biāo)本，部分置于Eppendorf管中－80℃保存?zhèn)溆?，部分置于Trizol液中－80℃保存以提取RNA。

1.3 腎組織中Ⅰ型IP3R蛋白的免疫組織化學(xué)檢測(cè) 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。結(jié)果判斷:棕褐色的陽(yáng)性顆粒為IP3R蛋白的表達(dá)。在高倍鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)腎小球細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.4 腎組織中Ⅰ型IP3R mRNA的RT-PCR檢測(cè)采用Trizol一步法提取腎組織總RNA。紫外分光光度法測(cè)定RNA純度和含量。按照試劑盒說(shuō)明兩步法擴(kuò)增Ⅰ型IP3R基因，以β-actin作內(nèi)參照。β-actin上游引物序列5’-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3’，下 游 引 物 序 列 5’-CCCATACCCACCATCA CACC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為207 bp;IP3R上游引物序列 5’-GGTTTCATCTGCAAGCTAATAAAA-3’，下游引物序列5’-AATGCTTTCATGGAATACTCGGTC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為525 bp。反應(yīng)體系共50μL，擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán);72℃延伸6 min。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物在20 g/L的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。以目的基因和β-actin條帶灰度值的比值代表目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 14.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用方差分析和SNK-q檢驗(yàn)比較各組大鼠24 h尿蛋白、血糖、右腎質(zhì)量指數(shù)和Ⅰ型IP3R蛋白及mRNA表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠24 h尿蛋白、血糖及右腎質(zhì)量指數(shù)比較 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠24 h尿蛋白、血糖和右腎質(zhì)量指數(shù)比較

2.2 各組大鼠Ⅰ型IP3R蛋白和mRNA表達(dá)結(jié)果比較 見(jiàn)表2和 圖1。Ⅰ型IP3R蛋白主要分布于腎小球系膜細(xì)胞、毛細(xì)血管袢和血管平滑肌細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)。

表2 各組大鼠腎臟Ⅰ型IP3R蛋白和mRNA表達(dá)水平比較

圖1 各組大鼠腎組織IP3R蛋白的表達(dá)(SP，×400)A:正常對(duì)照組;B:DN 3周組;C:DN 6周組;D:DN 12周組。

3 討論

作者通過(guò)制備DN大鼠動(dòng)物模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)、RT-PCR技術(shù)檢測(cè)大鼠腎臟Ⅰ型IP3R蛋白質(zhì)的定位、表達(dá)及mRNA水平的變化，發(fā)現(xiàn)Ⅰ型IP3R主要表達(dá)于腎小球系膜細(xì)胞、毛細(xì)胞血管袢和血管平滑肌細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，正常時(shí)染色較弱。DN 3周組Ⅰ型IP3R表達(dá)即增強(qiáng)，DN 12周組時(shí)增強(qiáng)更為明顯，提示隨病情的進(jìn)展，DN時(shí)腎臟組織中Ⅰ型IP3R表達(dá)上調(diào)。RT-PCR結(jié)果顯示:DN3周組Ⅰ型IP3R mRNA即開始增加，DN 12周時(shí)達(dá)到最高值，提示Ⅰ型IP3R蛋白的增加可能是在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)節(jié)的。有研究［11］報(bào)道，IP3與 IP3R結(jié)合后致Ca2+通道開放，鈣庫(kù)釋放Ca2+，胞質(zhì)游離Ca2+濃度升高引起細(xì)胞收縮，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞收縮引起腎血流量減少;腎小球系膜細(xì)胞收縮不僅使腎小球血管阻力增加，還可以導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)面積減少;兩者均收縮導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)率急劇減少［12］，腎功能受損，從而可能成為DN發(fā)生的一個(gè)因素。因此DN時(shí)腎臟Ⅰ型IP3R表達(dá)明顯增加，可能提高了腎臟對(duì)縮血管物質(zhì)的敏感性，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平驟然增高，使腎臟血管平滑肌細(xì)胞與腎小球系膜細(xì)胞收縮，腎血流減少及腎小球?yàn)V過(guò)面積減少，腎小球?yàn)V過(guò)率降低，腎功能下降，從而可能導(dǎo)致DN的發(fā)生。由于該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)目較少，大鼠DN的病程還不夠長(zhǎng)，以上結(jié)論還有待于進(jìn)一步研究證明。

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