趙作濤 李麗麗 王曉陽 萬喆 陳偉 李若瑜

(北京大學第一醫(yī)院皮膚性病科，北京大學真菌和真菌病研究中心，北京 100034)

近年來，隨著廣譜抗生素、抗腫瘤藥物、糖皮質類固醇激素和免疫抑制劑在臨床上的廣泛應用，器官移植及導管技術的活躍開展，艾滋病和糖尿病的發(fā)病率的上升，免疫受損患者不斷增多，曲霉屬和毛霉目真菌感染的發(fā)病率呈急劇上升趨勢，是免疫受損患者，特別是造血干細胞移植、器官移植及腫瘤放化療患者的主要致死因素之一［1-2］。曲霉現(xiàn)已成為我國僅次于念珠菌的第二位條件致病性真菌，其感染死亡率高，如免疫受損患者發(fā)生侵襲性曲霉感染的病死率可高達90%;而毛霉目真菌的感染近年來也有不斷增多趨勢，特別在重癥糖尿病和器官移植患者發(fā)生的急進性感染?？裳杆傥＜盎颊呱?-4］。曲霉屬和毛霉目真菌的臨床表現(xiàn)比較相似，但兩者對不同抗真菌藥物敏感性不盡相同，治療與預后也不同。因此，正確鑒別真菌的種類是提高治愈率的關鍵。然而，傳統(tǒng)的真菌病原體診斷方法存在耗時久、敏感性和特異性低的缺陷，遠遠不能滿足臨床早期特異診斷的需要。本研究使用靶向真菌的保守序列18S和28S rDNA區(qū)域的真菌通用引物，應用PCR方法進行擴增，再根據(jù)具有種特異性序列特征的ITS1區(qū)和ITS2區(qū)域設計具有種特異性的探針對PCR擴增產物進行反向線點雜交，擬鑒定曲霉屬和毛霉目真菌至種的水平［5-6］。并與傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定方法、ITS區(qū)DNA測序方法鑒定結果比較，驗證RLB方法的敏感性和特異性，擬為臨床快速鑒定和早期診斷曲霉屬和毛霉目真菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗菌株 收集我院真菌與真菌病研究中心保藏的98株臨床分離菌株，其中包括煙曲霉15株、黃曲霉12株、黑曲霉11株、土曲霉15株、構巢曲霉菌4株、凍土毛霉菌11株、總狀毛霉菌4株、卷曲毛霉菌5株、少根根霉5株、小孢根霉10株、微小根毛霉2株、傘狀犁頭霉4株，以及8株實驗對照菌株，分別為白念珠菌、茄病鐮刀菌、尖端賽多孢菌、馬爾尼菲青霉、疣狀瓶霉、棒曲霉、日本曲霉以及雅致小克銀漢霉各1株(見表1)。

試劑 EDAC，Sigma公司;Biodyne C尼龍膜，Pall公司;鏈親和素-過氧化物酶，Roche公司;化學發(fā)光增強劑(ECL)，Roche公司;X線片，Amersham公司。

表1 98株實驗菌株的和8株對照菌株的傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定，ITS區(qū)序列分析與RLB鑒定結果Tab.1 Ninety-eight well-characterized fungal strains and 8 control stains identified by the conventional morphological methods，ITS senquence analysis and RLB assay

主要實驗儀器 PCR儀，Perkin-Elmer 9600 Thermal Cycler，Eppendorf公司;Miniblotter，Immunetic公司;雜交箱，Thermo公司;暗盒，Amersham公司;測序儀，ABI PRISM 373 DNA sequencer;Labculture超凈工作臺，Esco公司;Incubator生化培養(yǎng)箱，Sanyo公司;臺式高速離心機，TGL-16G上海醫(yī)用分析儀器廠;瓊脂糖凝膠電泳儀，Mupid，Advance公司;凝膠成像儀，BIORAD公司。

1.2 方法

引物、探針的選擇與設計 引物和探針序列見表2。本研究使用的引物為真菌通用引物:ITS1和ITS4，長度為19～20 bp，退火溫度在55.75～61.88℃，擴增片段大小在 600 ～700 bp。PCR的引物5＇末端使用生物素標記，以便通過鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶底物結合來檢測。使用的探針為種特異性探針，為了能夠在一致的體系條件下雜交，探針設計成具有相似的物理特性;長度在 20～29 bp，退火溫度為 54.48～63.68℃ (見表2);使用Genbank中的序列進行比對。所有的探針5＇末端用胺標記以和尼龍膜共價鍵的結合，使探針在尼龍膜上條帶狀排列并且可以重復使用尼龍膜。

表2 本研究使用的引物和探針Tab.2 Oligonucleotide primers and probes used in this study

探針 AFUM、ANIG、ATER、ANID 引用文獻，AFLU在文獻所給探針的基礎上有所改造［7-8］;探針 MHEI、MRAC、MCIR、RAPP、RMIC、RPUS、ACOR由本課題研究者設計，設計方法為:首先在NCBI上查找出所用的12株真菌的核糖體DNA序列(包括18S部分區(qū)域、ITS1區(qū)、5.8S、ITS2區(qū)和28S部分區(qū)域)，利用序列對比軟件DNAMEN對真菌的rDNA序列進行對比，在ITS1或ITS2區(qū)找出每種真菌特異性序列，再引物設計軟件Primer 5和Oligo 6對該段特異性序列進行檢測，確保所設計的探針不形成發(fā)夾結構。

所有引物5＇端生物素標記、探針5＇末端用胺標記、引物和探針合成及標記均由Sangon公司完成。

探針標記 為了優(yōu)化雜交的條件，我們在前期工作基礎上將探針以0.6 μmol/L為起始濃度進行倍比稀釋，選定的最適終濃度為0.6 pmol/L，標膜的具體步驟見參考文獻［5-9］。

真菌DNA提取 我們在前期工作基礎上，對氯化芐法進行改良，具體操作詳見參考文獻［10-11］。

PCR反應體系 PCR反應總體積為25 μL，含模板 DNA 1 μL，10 × Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.25 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，引物 50 pmol/L 各 0.5 μL，Taq 酶 (5 U/μL)0.1 μL，補超純水至 25 μL。

PCR反應條件 95℃ 15 min，擴增變性、退火、延伸的條件分別為94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。取8 μL PCR產物于1.5%的瓊脂糖中電泳30 min后染色30 min，于凝膠成像系統(tǒng)照相，剩余的PCR產物用于RLB雜交。

雜交 RLB雜交的方法基于文獻報道及前期工作方法改良而成，具體步驟見參考文獻［5-9］。RLB的結果的判定標準為:標記有種特異性探針對應的底片位置上，出現(xiàn)黑點，表示結果為陽性。無黑點，表示結果為陰性。

RLB敏感性檢測 通過煙曲霉基因組DNA濃度10倍倍比稀釋法進行稀釋，將獲得的不同濃度的DNA進行PCR擴增，繼之行RLB雜交，可以見到RLB雜交信號的最低濃度即為RLB的敏感性。

3種鑒定方法的比較 通過RLB雜交方法鑒定結果與傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定方法，ITS區(qū)測序方法結果進行比較，進一步評價該方法的敏感性和特異性。

2 結 果

2.1 真菌培養(yǎng)及形態(tài)學鑒定

將實驗所用的臨床分離菌株標本轉種培養(yǎng)后，觀察菌落的形態(tài)和顏色，并在鏡下觀察真菌分生孢子頭或孢子囊的形態(tài)、菌絲橫徑、分枝、有無橫隔，可以對真菌進行初步形態(tài)學鑒定，見表1。

2.2 PCR產物凝膠電泳結果

98株實驗菌株均能用真菌通用引物擴增出相應的條帶，目的片段與預期一致，600～700 bp大小(見圖1)。

2.3 DNA 測序結果

98株菌臨床分離株得到良好的測序結果，與GenBank和CBS的菌種基因序列庫比對后，得到相應的比對結果(見表1)。

2.4 RLB 結果

本研究選取的98株實驗菌株中，均能夠通過利用自主設計的種特異性探針檢測出結果，相互之間并無交叉反應(見圖2)。本研究所用的98株臨床分離株RLB結果見表1。對于98株臨床分離株，RLB鑒定結果與傳統(tǒng)真菌鑒定方法 (真菌培養(yǎng)及鏡檢)、DNA測序結果完全一致。8株對照菌株，分別為白念珠菌，茄病鐮刀菌，尖端賽多孢菌，馬爾尼菲青霉，疣狀瓶霉，棒曲霉，日本曲霉以及雅致小克銀漢霉均未不能為RLB方法鑒定。

2.5 RLB敏感性檢測結果

通過煙曲霉基因組DNA濃度10倍倍比稀釋法，RLB可以檢測的最低基因組DNA濃度為1.8×10-3ng/μL(見圖3)。

3 討 論

早期診斷并開展針對性的治療可以降低真菌感染的病死率，是提高治愈率的關鍵。但是，對于曲霉和毛霉目真菌感染，傳統(tǒng)的病原體診斷方法存在耗時久、敏感性和特異性低的缺陷，遠遠不能滿足臨床早期特異診斷的需要。如直接鏡檢法可見到菌絲，但曲霉和毛霉目真菌形態(tài)相似，陰性結果亦不能排除診斷。傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)法可以確定真菌的種類，但耗時長，陽性率較低。病理學檢查在組織中查到真菌是疾病診斷的“金標準”，但是組織病理學檢查常常無特異性，不能將真菌鑒定到種的水平。而免疫組化及原位雜交技術目前也僅限于少數(shù)種類真菌的診斷及鑒定，這就限制了該兩項技術的臨床應用。因此，建立一種快速、敏感且可以同時鑒定多種臨床常見曲霉和毛霉目真菌的方法十分必要。

分子生物學技術的飛速發(fā)展，廣泛應用于病原真菌的分型、鑒定和親緣關系研究，為早日解決真菌感染的早期、特異診斷這一難題提供了良機［12］。PCR相關技術因具有敏感性高，特異性好，快速、便捷的優(yōu)勢，是目前最常用的分子生物學診斷手段，這些技術包括利用 PCR［13］、巢氏 PCR［14］、多重PCR［15］、Real time PCR［16］、限制性片段長度多態(tài)性分析［17］、RAPD［18］、ITS 區(qū)直接測序［19］、芯片技術等［20］。但是，鑒于致病真菌的物種多樣性，這些技術都有其自身局限性，例如，1次1種引物PCR擴增不可能檢測多種真菌感染，多重PCR擴增由于常見菌種的擴增片段大小較為接近，單純通過凝膠電泳常常無法鑒定;限制性片段長度多態(tài)性分析，1種酶切有時無法鑒別多種菌種，多種酶切，片段類型復雜，費時費力;探針雜交技術相對簡單可行，但是目前在念珠菌感染方面研究較多，鑒定真菌種類較少，且每次只能鑒定一種真菌，這些方法都無法滿足臨床快速一次高通量診斷的需要，無法同時檢測多種臨床常見的重要的真菌;而序列分析和芯片技術由于耗時較長、費用較高，均未廣泛應用于臨床診斷［12-20］。

文獻證實RLB技術可以檢測和鑒定臨床重要致病菌，包括細菌、病毒、寄生蟲和真菌［7-11］。與其他分子生物學方法相比，RLB方法具有很多優(yōu)點:易于操作，不需要使用凝膠電泳，具有費用低和省時的優(yōu)點;RLB方法使用序列種特異性探針來鑒定PCR產物，增加了檢測的敏感性(通過雜交以及顯色的信號放大)和特異性;只需1次PCR和1張膜即可以同時鑒定43株菌株，并且可以在1個工作日內完成;標記的膜可以重復使用50次以上均無明顯的信號丟失;MiniBlotter儀可以標記45道探針，所以還可以同時檢測以上所有臨床常見的致病真菌，并可加入其他靶基因，例如其他新發(fā)現(xiàn)的重要真菌種類，并且可以根據(jù)研究需要進行任意組合。尤其值得強調的是，RLB技術可以為真菌培養(yǎng)呈陰性結果及真菌混合感染的病例提供診斷。此外，RLB技術在早期診斷方面具有潛在的優(yōu)勢，尤其對于真菌培養(yǎng)需時長、病理診斷難以確定真菌的種類，RLB僅需1個工作日，包括DNA的提取 (大約3 h)、PCR(大約2 h)及用RLB技術檢測PCR產物(大約3 h)。而對于臨床樣本，我們通過用擴增較小片段的引物 (ITS1和ITS2、ITS3和ITS4)來縮短PCR循環(huán)時間，可以臨床早期診斷真菌感染。

圖1 12種真菌ITS區(qū)PCR擴增結果:1～12.12種菌的PCR結果 (分別為煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉、構巢曲霉、凍土毛霉菌、總狀毛霉菌、卷枝毛霉菌、少根根霉、小孢根霉、微小根毛霉、傘狀犁頭霉);M.100 bp ladder marker 圖2 反向線點雜交結果:1～12.12種菌的RLB結果 (分別為煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉、構巢曲霉、凍土毛霉菌、總狀毛霉菌、卷枝毛霉菌、少根根霉、小孢根霉、微小根毛霉、傘狀犁頭霉)。12種探針標記的順序與表2所列一致，每種探針標記2道代表不同的探針濃度 (0.2 pmol/L和0.4 pmol/L)。12種真菌的PCR產物與相應的種特異性探針雜交，未與其余探針結合 圖3 RLB敏感性檢測結果:通過煙曲霉基因組DNA濃度10倍倍比稀釋法，PCR/RLB 可以檢測的最低基因組 DNA 濃度為1.8 ×10-3ng/μL(1.陰性對照，2.1.8 ng/μL，3.1.8 ×10-1ng/μL，4.1.8 ×10-2ng/μL，5.1.8 ×10-3 ng/μL，6.1.8 ×10-4ng/μL，7.1.8 ×10-5ng/μL，8.1.8 ×10-6ng/μL)Fig.1 Results of PCR assay for 12 strains(Lanes 1 to 12 represent the 12 strains in the following order:A.fumigatus，A.flavus，A.niger，A.terreus，A.nidulans，M.heimalis，M.racemosus，M.cercinelloidea，R.arrhizus，R.microsporus，R.pusillus，A.corymbifera;M.100 bp ladder marker) Fig.2 Results of PCR-based reverse line blot hybridization assay(PCR/RLB)hybridization for 12 strains(Lanes 1 to 12 represent the 12 strains in the following order:A.fumigatus，A.flavus，A.niger，A.terreus，A.nidulans，M.heimalis，M.racemosus，M.cercinelloidea，R.arrhizus，R.microsporus，R.pusillus，A.corymbifera).The 12 labeled probes are in the same order as in Tab.2 Duplicate rows for the same probe represent different concentrations(0.2 pmol/L and 0.4 pmol/L).PCR products for the 12 strains were hybridized with the species-specific probes，but not any other probes Fig.3Analytical sensitivity of PCR/RLB assay.The analytical sensitivity of PCR/RLB assay was 1.8 ×10-3ng/μL by 10-fold serial dilution of Aspergillus fumigatus genomic DNA(1.Negative control，2.1.8 ng/μL，3.1.8 ×10-1ng/μL，4.1.8 ×10-2ng/μL，5.1.8 ×10-3ng/μL，6.1.8 ×10-4ng/μL，7.1.8 ×10-5ng/μL，8.1.8 ×10-6ng/μL)

Zeng和Playford等應用RLB技術來檢測一些臨床常見的念珠菌、曲霉菌和隱球菌［7-8］。但是遺憾的是他們的研究沒有涵括毛霉目真菌，而毛霉目真菌的感染發(fā)病率增加，特別在重癥糖尿病和器官移植患者發(fā)生的急進性感染死亡率高，具有重要的臨床意義［3-4］。但是曲霉屬和毛霉目真菌，二者形態(tài)學近似，特別是當病理學檢查，真菌成分數(shù)量少、菌絲腫脹變形時，僅根據(jù)真菌的排列方式和真菌形狀難以鑒別二者。

據(jù)此，在本研究中，我們利用RLB技術檢測12種臨床重要的曲霉屬和毛霉目真菌，包括5種曲霉屬和7種毛霉目真菌。通過對98株臨床分離菌株提取真菌的DNA后用RLB技術鑒定，結果顯示與真菌形態(tài)學鑒定結果、ITS區(qū)測序結果相一致，菌種之間沒有出現(xiàn)交叉雜交。本研究顯示RLB技術檢測與傳統(tǒng)真菌鑒定方法，DNA測序及病理學檢查比較，具有敏感性高 (1.8×10-3ng/μL)，特異性較高(100%)的特點，可以作為流行病學調查的工具及進一步應用于臨床標本的快速診斷，具有很好的臨床應用前景。

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