周鳳麗 畢筱剛 張?zhí)焱?黃靜

肺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢，已經(jīng)成為一種嚴重威脅人類健康與生命安全的疾病。目前肺癌的治療療效仍然未取得突破性的進展，尋找新的多方面的治療途徑仍然是目前需要解決的問題，免疫基因治療就是有待研究的主要治療途徑之一。

肺泡巨噬細胞（alveolar macrophage, AM）是肺部防御的首要細胞，占正常人支氣管肺泡灌洗液中細胞總數(shù)的80%以上。AM具有多種抗腫瘤功能，能通過直接融解和吞噬作用，還能分泌多種細胞因子，如：腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）、一氧化氮（nitric oxide,NO）、白細胞介素I（interleukin I, IL-1）等，起到抗腫瘤的作用?；罨腁M抗腫瘤活性明顯增強，干擾素-γ（interferon-γ, INF-γ）是很強的巨噬細胞活化因子，直接作用于巨噬細胞即能促進巨噬細胞的吞噬和分泌功能[1]。利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將某些特殊的基因轉(zhuǎn)入巨噬細胞從而改變巨噬細胞的免疫功能的研究國內(nèi)外均有報道[2-5]，但多為動物（鼠）的腹腔AM的實驗或人AM的非抗腫瘤功能的研究。本文設(shè)計利用INF-γ體外轉(zhuǎn)入肺癌患者AM，觀察AM抗腫瘤功能的變化，為臨床應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)于肺癌的免疫基因治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗對象 肺癌患者，共30例，均經(jīng)病理證實，其中小細胞肺癌8例，非小細胞肺癌22例。既往未經(jīng)任何治療。

1.2 AM的收集 按常規(guī)纖維支氣管鏡操作進行支氣管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage, BAL），以37oC的滅菌生理鹽水，每次50 mL，注入后立即抽吸，反復(fù)4次，收集灌洗液。以貼壁分離的方法分離和純化AM，臺盼藍染色，倒置顯微鏡下鑒定。

1.3 將人INF-γ CDNA構(gòu)建于真核表達質(zhì)粒，獲表達人INF-γ基因的真核表達載體 利用雙酶切定向克隆技術(shù)，將人INF-γ全長cDNA與表達質(zhì)粒pREP-8的DNA相連接，構(gòu)建成真核表達質(zhì)粒Prep-8-INF-γ（由上海銳谷生物科技有限公司完成）。

1.4 將純化的AM與人IFN-γ基因轉(zhuǎn)染液共同孵化 在24孔板上分別加入AM 1×106/孔，INF-γ基因轉(zhuǎn)染液100 μL/孔（設(shè)不表達INF-γ的質(zhì)粒對照和磷酸鈣對照）。置37oC、5%CO2中孵育2 h，洗去轉(zhuǎn)染液。孵育后的AM，加含10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集培養(yǎng)上清液及AM。

1.5 RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染了INF-γ基因的AM總RNA的RTPCR產(chǎn)物

1.6 上清液檢測

1.6.1 INF-γ的活性測定 采用ELISA法[6]。

1.6.2 TNF-α含量測定 采用ELISA法。按北京邦定生物醫(yī)學(xué)公司試劑盒提供的操作程序進行，測波長570 nm處的OD值。

1.6.3 NO含量測定 采用Gries法。將亞硫酸鈉標準液稀釋為320 μmol/L、160 μmol/L、80 μmol/L、40 μmol/L、20 μmol/L、10 μmol/L、和5 μmol/L 7個濃度，加入96孔板，每份樣品3個復(fù)孔；將待測AM培養(yǎng)上清和空白對照（只加蒸溜水）加入另一行96孔板中，所有樣品均加0.1 mL，均為3個復(fù)孔；然后各孔加入Gries試劑0.1 mL，室溫顯色10 min后用酶標儀上570 nm波長測OD值。用計算和繪制標準曲線即可推算出NO含量。

1.6.4 IL-1含量測定 參照文獻[7]，樣本作1:5稀釋，各板設(shè)標準品校正孔，依據(jù)標準曲線換算各樣本中IL-1含量。

1.7 AM殺傷活性的檢測 用MTT間接比色法[6]。收集對數(shù)生長期的L1210細胞，經(jīng)Hanks’液洗后，用RPMI-1640液完全培養(yǎng)基配成1×106/L備用。取1×107/L的AM加入96孔板中，每孔100 μL，1.5 h后以Hanks’液洗2次，再加入L1210細胞（100 μL/孔），每一樣品設(shè)3個復(fù)孔及L1210細胞對照。于37oC下24 h后，振蕩懸浮細胞。每孔取100 μL加入另一96孔板中，各加入5 g/L的MTT 20 μL/孔，培養(yǎng)4 h后，再加入100 g/L的SDS100 μL/孔，6 h-8 h后，用酶標儀測定570 nm的OD值。并計算殺傷活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果以Mean±SD表示。組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AM活力測定 對貼壁分離的AM用臺盼籃染色法測定細胞活力，其中活細胞不染色，結(jié)果表明活細胞率達95%以上。

2.2 RT-PCR檢測結(jié)果 INF-γ基因只在轉(zhuǎn)染了Prep-8-INF-γ的AM內(nèi)轉(zhuǎn)錄，在相當于350 bp處有一清晰的條帶，而在未轉(zhuǎn)染Prep-8-INF-γ肺癌患者的AM內(nèi)無轉(zhuǎn)錄（無相應(yīng)的條帶），磷酸鈣對照亦無相應(yīng)的條帶出現(xiàn)（圖1）。

2.3 INF-γ基因轉(zhuǎn)染后巨噬細胞培養(yǎng)上清液中INF-γ活性的檢測結(jié)果 INF-γ基因轉(zhuǎn)染AM培養(yǎng)上清液中4 h即能檢測到INF-γ，7 d后檢測到INF-γ的水平為（34.5±3.2）ng/mL；而不表達INF-γ的質(zhì)粒對照組檢測到的INF-γ平均值為（5.5±1.6）ng/mL?；蜣D(zhuǎn)染組和對照組比較INF-γ水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.739, P＜0.001）。

2.4 INF-γ基因轉(zhuǎn)染后巨噬細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、NO和IL-1水平的檢測結(jié)果 INF-γ基因轉(zhuǎn)染后AM培養(yǎng)上清液中TNF-α水平明顯高于質(zhì)粒對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；INF-γ基因轉(zhuǎn)染后AM培養(yǎng)上清液中NO水平明顯高于質(zhì)粒對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；INF-γ基因轉(zhuǎn)染后AM培養(yǎng)上清液中IL-1水平明顯高于質(zhì)粒對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）（表1）。

2.5 INF-γ基因轉(zhuǎn)染后AM對L1210細胞的殺傷活性的檢測結(jié)果 INF-γ基因轉(zhuǎn)染后AM對L1210細胞的殺傷率為（68.9±5.9）%，而質(zhì)粒對照組對L1210細胞的殺傷率為（15.5±2.1）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=72.482, P＜0.001）。

表1 基因轉(zhuǎn)染組和對照組AM培養(yǎng)上清液中TNF-α、NO和IL-1水平（Mean±SD）Tab 1 The content of TNF-α, NO and IL-1 in incubating solution of alveolar macrophages of two groups (Mean±SD)

圖1 RT-PCR檢測AM內(nèi)INF-γ基因轉(zhuǎn)錄條帶圖。M：marker；1：未轉(zhuǎn)染INF-γ基因的肺泡巨噬細胞中總RNA的RT-PCR產(chǎn)物；2：轉(zhuǎn)染了INF-γ基因的AM總RNA的RT-PCR產(chǎn)物；3：磷酸鈣對照。Figure 1 the figure of INF-γ gene transcription of AMs with RT-PCR.M：marker；1: the RT-PCR product of total RNA in AMs that INF-γ gene were not transfected into; 2: the RT-PCR product of total RNA in AMs that INF-γ gene were transfected into; 3: the control of calcium phosphate.

3 討論

巨噬細胞具有免疫功能，國內(nèi)外的研究[2-5]顯示，利用體外基因轉(zhuǎn)染技術(shù)可以改變巨噬細胞的免疫活性。抗腫瘤免疫功能是巨噬細胞的重要免疫功能之一，巨噬細胞也是主要的腫瘤免疫細胞，而肺組織中大量的AM起著重要的抗肺癌的免疫功能，巨噬細胞的活化是其抗腫瘤功能的基礎(chǔ)，能否通過體外基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將巨噬細胞活化因子INF-γ基因轉(zhuǎn)入AM，從而使AM活化，使其抗肺癌活性增強，是本研究的目的。

巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子是其抗腫瘤活性的主要途徑，TNF-α、NO、IL-1是AM分泌的具有抗腫瘤效應(yīng)的主要細胞因子，TNF-α可引起腫瘤細胞壞死和導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡[8-10]；IL-1可通過激活細胞毒T淋巴細胞起到殺腫瘤細胞的作用；NO可阻斷腫瘤細胞的能量代謝和DNA復(fù)制而抑制腫瘤細胞生長，還可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[11]。本研究結(jié)果顯示，肺癌患者的AM經(jīng)體外轉(zhuǎn)染人INF-γ基因后，其培養(yǎng)上清液中TNF-α、NO、IL-1的含量均較對照組明顯增高（均為P＜0.001），提示人INF-γ基因轉(zhuǎn)染后，肺癌患者AM產(chǎn)生以上3種細胞因子的活性明顯增強，提示其抗腫瘤活性明顯增強。

巨噬細胞還可通過吞噬作用和依賴跨膜型腫瘤壞死因子的接觸溶解起殺傷腫瘤細胞的作用。小鼠淋巴細胞白血病細胞株L1210細胞被廣泛用于巨噬細胞殺瘤活性的檢測[12,13]，本研究檢測AM殺傷L1210細胞的活性結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了人INF-γ基因的肺癌患者AM殺傷L1210細胞的能力較對照組明顯增強，直接說明肺癌患者AM抗腫瘤活性在轉(zhuǎn)染了人INF-γ基因后明顯增強。

激活的巨噬細胞才能具有分泌功能和殺傷活性。INF-γ是巨噬細胞激活劑中作用最強的細胞因子之一，INF-γ直接與AM培養(yǎng)都能激活A(yù)M使之抗腫瘤活性增強[1]。我們采用體外基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將人INF-γ基因轉(zhuǎn)入肺癌患者AM，RT-PCR顯示INF-γ基因只在轉(zhuǎn)染了Prep-8-INF-γ的AM內(nèi)轉(zhuǎn)錄，同時檢測到AM培養(yǎng)上清液中INF-γ的高濃度表達，說明轉(zhuǎn)染是成功的；同時檢測到轉(zhuǎn)染了人INF-γ基因的AM培養(yǎng)上清液中TNF-α、NO、IL-1三種細胞因子均較對照組明顯升高（均為P＜0.001），且其殺傷L1210細胞活性亦明顯較對照組增強（P＜0.001），提示AM已明顯被激活，具有抑瘤和殺瘤的作用。

本研究采用的體外基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將人INF-γ基因轉(zhuǎn)入肺癌患者AM，使其抗腫瘤活性明顯增強，為將來臨床應(yīng)用體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)增強AM抗肺癌作用的研究提供了實驗基礎(chǔ)。