劉一臻 綜述 王明榮 審校

肺癌是當(dāng)今世界各國(guó)最常見的惡性腫瘤，其死亡率居于各種腫瘤的首位，對(duì)人類健康和生命構(gòu)成極大威脅。在我國(guó)，肺癌每年約致40萬(wàn)例患者死亡[1]。然而，研究顯示I期肺癌術(shù)后10年生存率可達(dá)到92%[2]。因此，降低肺癌患者死亡率的關(guān)鍵在于早期診斷和早期治療。

關(guān)于早期肺癌的概念在國(guó)際上依然存在著不同的觀點(diǎn)，有學(xué)者認(rèn)為原位癌和Ia期肺癌為早期肺癌[3]，也有認(rèn)為早期肺癌是指全部I期肺癌[4]，還有學(xué)者認(rèn)為I期和II期都屬于早期[5]，另有認(rèn)為直徑＜3 cm即為早期肺癌[6]。隨著肺癌病因?qū)W、分子標(biāo)志物研究工作的進(jìn)展，以及低劑量螺旋CT、熒光纖維支氣管鏡和液基細(xì)胞學(xué)在臨床的應(yīng)用，肺癌的早期診斷取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，本文擬就該領(lǐng)域的研究進(jìn)展作一綜述。

1 肺癌早期診斷方法

1.1 影像學(xué)檢查 胸部X光片優(yōu)點(diǎn)是能觀察胸部各種結(jié)構(gòu)的全貌，經(jīng)濟(jì)且方便。但因其分辨率低、組織結(jié)構(gòu)互相重疊，在肺癌早期診斷方面并不具優(yōu)勢(shì)，更精確的數(shù)字化成像可能是未來的發(fā)展方向之一[7]。低劑量螺旋CT（low-dose CT, LDCT）優(yōu)點(diǎn)是可以檢測(cè)到2 mm-3 mm的小結(jié)節(jié)，盡管有報(bào)道LDCT篩查不能明顯提高生存率[8]，但在全美范圍內(nèi)進(jìn)行的大型隨機(jī)肺癌篩查（National Lung Screening Trial, NLST）研究的初步結(jié)果顯示，其可降低肺癌死亡率達(dá)20%[9]。鑒于現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)不一致，2010年肺癌NCCN指南暫不推薦在非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐中常規(guī)進(jìn)行CT篩查。PET雖在肺癌早期診斷應(yīng)用方面并無(wú)定論，但其已成為輔助肺癌分期的重要手段，采用PET/CT對(duì)早期患者進(jìn)行準(zhǔn)確分期，可以避免不恰當(dāng)?shù)氖中g(shù)[10]。

1.2 支氣管內(nèi)鏡 各種支氣管內(nèi)鏡的發(fā)展使得其在肺癌早期診斷中發(fā)揮越來越重要的作用。自發(fā)熒光支氣管鏡（autofluorecence bronchoscopy, AFB）較之常規(guī)白光支氣管鏡（white-light bronchoscop, WLB）不僅可提高早期癌變的檢出率，也可更清晰地顯示腫瘤的輪廓。一項(xiàng)在大于1,000例的比較研究[11]中顯示，單用WLB可檢測(cè)到40%的侵襲前病例，而聯(lián)用AFB可將檢出率提高到80%。但AFB對(duì)于侵襲前病變?cè)\斷特異性較低，自發(fā)熒光成像電子支氣管鏡系統(tǒng)（auto-fluorescence imaging, AFI）可通過檢測(cè)區(qū)域的顏色區(qū)分癌前病變和支氣管的良性改變，從而解決了這一難題。此外，窄帶成像支氣管鏡（narrow band imaging, NBI）可對(duì)支氣管粘膜及血管進(jìn)行清晰顯示，故在鱗癌的癌前病變?cè)\斷方面具有很大優(yōu)勢(shì)。將自發(fā)熒光和窄帶成像統(tǒng)一結(jié)合于電子支氣管鏡成像系統(tǒng)上可能是未來的發(fā)展方向，其可減少臨床操作時(shí)間，同時(shí)可避免一些不必要的活檢操作[12]。

2 肺癌分子標(biāo)志物

肺癌的發(fā)生是多因素致病、多基因參與和多階段發(fā)展的復(fù)雜過程，鑒于以上種種檢查手段的敏感性、特異性、適用度等方面的局限，近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)有關(guān)肺癌早期診斷的分子標(biāo)志物做了大量有益的探索。

2.1 染色體水平 等位基因丟失或雜合性丟失在肺癌早期常被探測(cè)到，如3p14、9p21、17p13、13q14、5q21、1q、2q和8q，它們也可在吸煙者或既往吸煙者的組織學(xué)正常或增生上皮中探測(cè)到。最常發(fā)生異常改變的是3p[13,14]，這也是諸多抑癌基因（tumor suppressor gene, TSG）所在的染色體區(qū)段。最近一項(xiàng)在痰液中檢測(cè)染色體非整倍性的病例對(duì)照研究[15]顯示，一組FISH探針（EGFR、MYCC、5p15及CEP6）聯(lián)合痰細(xì)胞學(xué)，可提前于常規(guī)診斷18個(gè)月預(yù)測(cè)肺癌發(fā)生，診斷敏感度和特異性分別為76%和88%。

2.2 DNA水平 腫瘤是一種由多個(gè)關(guān)鍵基因的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變導(dǎo)致的轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆增殖的疾病，關(guān)鍵基因的改變可以是胚系突變或體細(xì)胞突變。

華盛頓大學(xué)基因研究所在188例肺腺癌中對(duì)623個(gè)與肺癌發(fā)生有已知或潛在關(guān)系的基因進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了多于1,000個(gè)體細(xì)胞突變，最終確定了26個(gè)最常見的突變，涉及TP53、KRAS、STK11、EGFR、LRP1B等基因[16]。對(duì)這些基因進(jìn)行大樣本的臨床驗(yàn)證，可能發(fā)現(xiàn)有助于早期診斷的標(biāo)志物。

Belinsky等[17]發(fā)現(xiàn)一組基因的甲基化在診斷肺癌方面具有較高的敏感度和特異性。他們收取了3,259例患者的痰液，其中182例被診斷為肺癌，具有高質(zhì)量DNA的病例有98例，非癌組92例作為對(duì)照。共檢測(cè)了14個(gè)基因的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)6個(gè)（P16、MGMT、DAPK、RASSFIA、PAX5β及GATA5）與肺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高相關(guān)，其中3個(gè)或更多個(gè)基因的共同甲基化可增加6.5倍肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)肺癌檢出的敏感性和特異性均為64%。研究者認(rèn)為此敏感性還不足以在大規(guī)模人群中開展前瞻性研究，有待對(duì)候選基因進(jìn)行更多的驗(yàn)證。

Spira等[18]檢測(cè)了129例接受了支氣管鏡刷檢的吸煙者的支氣管上皮細(xì)胞，并一直隨訪到檢查者最終獲得活檢/手術(shù)病理結(jié)果，有60例被診斷為肺癌，69例無(wú)肺癌。研究者用其中77例作為實(shí)驗(yàn)組通過表達(dá)譜芯片得到一組含80個(gè)基因的標(biāo)志物，并在其余52例樣本中進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其診斷敏感度和特異性分別為80%和84%。在92例支氣管鏡未確診患者中，診斷敏感度和特異性分別為89%和83%。將標(biāo)志物與支氣管鏡合用，診斷敏感性和陰性預(yù)測(cè)率均高達(dá)95%，尤其對(duì)于I期肺癌，標(biāo)志物診斷的敏感性為90%，而常規(guī)支氣管鏡的敏感性為35%。通過此項(xiàng)研究，Spira等認(rèn)為在細(xì)胞學(xué)正常的支氣管上皮標(biāo)本中的基因表達(dá)也可作為肺癌的診斷標(biāo)志物。

關(guān)于循環(huán)腫瘤細(xì)胞DNA的研究[19,20]也有很多，但由于缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)、各項(xiàng)研究所采用的界值不一致、可重復(fù)性較差等問題，迄今還沒有實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用。

2.3 蛋白水平

2.3.1 血清蛋白改變 血清蛋白標(biāo)志物檢測(cè)具有高效、高靈敏性、性價(jià)比高、方便簡(jiǎn)捷、快速、標(biāo)本易獲取及創(chuàng)傷小的特點(diǎn)。目前在肺癌中研究的血清腫瘤相關(guān)抗原標(biāo)志物有CEA、NSE、TPA、Chromogranine、CA125、CA19-9、Cyfra21-1，敏感性和特異性在50%-90%不等，大部分標(biāo)志物隨病變進(jìn)展陽(yáng)性檢出率增高。

Garaci等[21]在534例個(gè)體的外周血中對(duì)TLP進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其在非小細(xì)胞肺癌患者中的檢出率為53.1%，而在其它類型腫瘤患者中未檢測(cè)到。在I期肺癌中有75%可檢測(cè)到TLP。Tarro等[22]總結(jié)文獻(xiàn)報(bào)道的肺癌血清標(biāo)志物研究的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，作為I期肺癌診斷標(biāo)志物，TLP的檢出敏感性和特異性分別為66.7%和80%，而其它常見血清標(biāo)志物CA19-9為33.3%和100%，Cyfra21-1為11.1%和100%，CA125為11.1和100%，CEA為0和100%。

Yang等[23]用質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)了158例肺癌患者和50例對(duì)照的血清，其中47例肺癌患者血清與20例正常對(duì)照作為實(shí)驗(yàn)組，發(fā)現(xiàn)5個(gè)標(biāo)志峰，然后在84例肺癌患者和30例正常對(duì)照中進(jìn)行盲性驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)敏感性為87%，特異性為80%。

Nisman等[24]檢測(cè)了37例肺部良性病變、88例非小細(xì)胞肺癌和37例小細(xì)胞肺癌患者血清中ProGRP、NSE、CYFRA21-1及CEA的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ProGRP在區(qū)分小細(xì)胞肺癌和肺部良性病變及非小細(xì)胞肺癌方面優(yōu)于NSE，特異性可達(dá)90%以上，ProGRP對(duì)于小細(xì)胞肺癌的檢出敏感性為95%，可能作為小細(xì)胞肺癌診斷的一個(gè)候選標(biāo)志物。

腫瘤相關(guān)自身抗體的檢測(cè)近年也有很大發(fā)展，一項(xiàng)在125例非小細(xì)胞肺癌患者和125例性別、年齡、吸煙狀態(tài)等因素匹配的正常對(duì)照中的研究顯示，CFH自身抗體可在51.5%的早期肺癌中檢測(cè)到，而在對(duì)照組中僅有8.0%[25]。另有研究顯示，一組由6個(gè)自身抗體構(gòu)成的血清蛋白標(biāo)志在高危人群中診斷肺癌的敏感性和特異性可分別達(dá)94.8%和91.1%[26]。

2.3.2 組織蛋白（標(biāo)志）變化 在支氣管活檢標(biāo)本中，p53的過表達(dá)是一個(gè)很有趣的標(biāo)志物，在化生中是不存在的，但在不典型增生中的存在程度與癌的形成密切相關(guān)。一項(xiàng)調(diào)查[27]結(jié)果顯示，p53表達(dá)陽(yáng)性率在輕度不典型增生病變中為19%，中度不典型增生為36%，原位癌為59%。一項(xiàng)在378例肺癌手術(shù)標(biāo)本中的免疫組化結(jié)果[28]顯示，UHRF1在幾乎一半的肺癌早期病例中均有表達(dá)，UHRF1特異表達(dá)于癌細(xì)胞的細(xì)胞核，而在手術(shù)切端組織、間質(zhì)細(xì)胞及炎性細(xì)胞中均不表達(dá)，可能作為肺癌早診的潛在蛋白標(biāo)志。

近些年，蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展以及蛋白芯片的應(yīng)用使得越來越多的標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，但還需在組織樣本與大規(guī)模人群中驗(yàn)證。

2.4 RNA水平 Sueoka等[29]用Real-time RT-PCR的方法檢測(cè)了44例肺癌患者、7例肺部增生病變患者、24例肺部良性病變患者及25例正常對(duì)照的血漿hnRNPB1水平，發(fā)現(xiàn)在肺癌患者中顯著高于正常對(duì)照及肺部良性病變者（P＜0.05）尤其在鱗癌患者中顯著高于腺癌患者水平。他們認(rèn)為其可作為一種無(wú)創(chuàng)篩查用于肺癌的早期診斷。Yu等[30]在痰液中研究發(fā)現(xiàn)一組miRNAs標(biāo)志（miR-21、miR-486、miR-375和miR-200b）可將肺腺癌患者和正常人群很好的區(qū)分開，敏感性和特異性分別達(dá)80.6%和91.7%。

還有很多其它mRNA表達(dá)譜的研究報(bào)道，但缺乏敏感性和特異性數(shù)據(jù)。

2.5 呼出氣體 呼出氣體是比痰液更易得的標(biāo)本，在這種樣本中尋找肺癌標(biāo)志物是一項(xiàng)新的有益探索。文獻(xiàn)[31,32]報(bào)道，呼出氣體中一組由VOCs構(gòu)成的標(biāo)志物可區(qū)分肺癌患者與正常受檢者。隨著檢測(cè)技術(shù)如TOF MS、PTRMS、SIFT-MS和激光光譜等的不斷發(fā)展，對(duì)呼出氣體及呼出氣冷凝液中肺癌標(biāo)志物的研究逐漸深入，但該領(lǐng)域總體仍處于較初級(jí)階段。輕便的檢測(cè)裝置、低廉的檢測(cè)價(jià)格以及結(jié)果的易于判讀，將會(huì)是此方面檢測(cè)今后應(yīng)用于臨床的重要發(fā)展方向[33]。

3 高危人群易感相關(guān)基因

迄今為止，在肺癌中研究者還沒有找到一種像APC與家族性結(jié)腸息肉病那樣關(guān)系密切的胚系突變。研究[34,35]認(rèn)為，遺傳有可能獨(dú)立于吸煙史或環(huán)境中煙草暴露劑量而成為發(fā)生肺癌的因素。Bailey-Wilson等[36]報(bào)道6q23-q25可能存在肺癌易感基因。

流行病學(xué)研究表明，肺癌易感風(fēng)險(xiǎn)增高與一些遺傳性癌癥綜合征有關(guān)，而這往往與p53[37]、EGFR[38]等基因的胚系突變有關(guān)。大規(guī)模全基因組關(guān)聯(lián)性研究[39,40]發(fā)現(xiàn)15q24-15q25.1區(qū)域的SNP與肺癌發(fā)生有關(guān)，其中包含兩個(gè)受尼古丁暴露劑量調(diào)控編碼煙堿乙酰膽堿受體alpha亞基的基因。另有研究[41]顯示，位于5p15.33的rs2736100與非吸煙女性患肺腺癌風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。

Wu等[42]在中國(guó)人群中發(fā)現(xiàn)與肺癌易感風(fēng)險(xiǎn)有顯著相關(guān)的四個(gè)SNP位點(diǎn)，即rs2036534C＞T、rs667282C＞T、rs12910984G＞A和rs6495309T＞C，其均位于15q25。該研究組還發(fā)現(xiàn)與肺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高顯著相關(guān)的其它一些位點(diǎn)，如：XRCC1 5'UTR區(qū)的SNP-77T＞C[43]，ERCC1 5’側(cè)翼區(qū)的-433T＞C和262G＞T[44]，F(xiàn)EN1啟動(dòng)子區(qū)的rs174538G＞A和rs4246215G＞T[45]，MAD1L1和MAD2L1的遺傳性變異[46]和CASP8啟動(dòng)子區(qū)6個(gè)核苷酸的缺失多態(tài)[47]。

表1綜合了近兩年肺癌全基因組關(guān)聯(lián)研究（genomewide association study, GWAS）的部分結(jié)果。GWAS可同時(shí)檢測(cè)基因組中成百上千的變異，從而發(fā)現(xiàn)疾病的候選基因，為人們研究腫瘤易感基因提供了新的方式，對(duì)了解腫瘤的發(fā)病機(jī)制提供了更多的線索。通過GWAS盡管已發(fā)現(xiàn)大量與肺癌相關(guān)的變異，但仍然僅占整個(gè)基因組變異中的一小部分，所起的作用也非常小。而且在這種情況下，很小的一點(diǎn)系統(tǒng)或隨機(jī)誤差都可能導(dǎo)致不正確的結(jié)果，故而在GWAS中基因數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制非常重要[53]。再者，正因?yàn)镚WAS僅關(guān)注于每種腫瘤基因組構(gòu)成中的一小部分基因變異,低估了腫瘤自然發(fā)生的復(fù)雜性。因此，對(duì)GWAS取得的發(fā)現(xiàn)仍需要大量長(zhǎng)期的隨訪方可定論，以闡明關(guān)聯(lián)之下的分子生物學(xué)機(jī)制，進(jìn)而評(píng)價(jià)肺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及疾病轉(zhuǎn)歸。

表1 肺癌的全基因組關(guān)聯(lián)研究Tab 1 Genome-wide association study of lung cancer

4 問題與展望

肺癌已成為世界癌癥死亡的首要原因，人們一直在不斷探索肺癌早期診斷的新技術(shù)，包括在血清、痰液、呼出氣體及支氣管活檢中尋找用于肺癌早期診斷的標(biāo)志物，甚至口腔上皮也被用于肺癌檢測(cè)[54]，所發(fā)現(xiàn)的大量標(biāo)志物均需經(jīng)過多中心大樣本的驗(yàn)證。多個(gè)標(biāo)志物的聯(lián)合應(yīng)用將會(huì)是未來標(biāo)志物檢測(cè)的重要發(fā)展方向之一。此外，基因工程小鼠模型在肺癌早期診斷研究中得到越來越多的關(guān)注，有可能成為今后研究方向之一，多光子顯微成像等多種影像技術(shù)的發(fā)展也使得小鼠模型在肺癌早期診斷中發(fā)揮越來越重要的作用[55]。

另一方面，在臨床中檢測(cè)特異標(biāo)志物的儀器設(shè)備需要進(jìn)一步發(fā)展。原位癌一般包括4層-38層細(xì)胞、且大多數(shù)病損有5層細(xì)胞的厚度，由非周圍型支氣管粘膜的異型細(xì)胞斑塊構(gòu)成，一般只有幾個(gè)毫米[56,57]，更何況潛在癌變的細(xì)胞克隆遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于現(xiàn)今測(cè)量技術(shù)可達(dá)的最小閾值，這就可以解釋為什么常規(guī)手段如胸片、CT和纖維支氣管鏡在早期診斷方面不那么有效了。需要開發(fā)出更準(zhǔn)確更敏感的技術(shù)，以期對(duì)肺癌進(jìn)行早期診斷。再者，對(duì)腫瘤早期的標(biāo)志物進(jìn)行動(dòng)態(tài)測(cè)定和與影像學(xué)方法相結(jié)合的分子影像技術(shù)的發(fā)展，將可能為肺癌的早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷帶來新的希望。有理由相信，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，21世紀(jì)人類對(duì)肺癌早診早治的工作會(huì)有更大的作為，將取得更大的成就。