王丹，姜建斌，陳其，禇茂平，錢燕

（1.溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 兒科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)學院附屬育英兒童醫(yī)院 心血管科，浙江 溫州 325000）

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是兒童心血管系統(tǒng)較為常見的疾病，可造成心源性猝死、心力衰竭，并可進展為心肌病[1]。VMC的發(fā)病機制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)心肌細胞感染病毒后絲裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated kinase，MAPK）通路活化，推測MAPK通路可能在VMC的發(fā)病過程中起重要作用。p38MAPK是新鑒定出的一條絲裂原活化蛋白激酶信號轉導蛋白，和病毒復制、心肌肥厚及纖維化等有關[2]。本實驗通過建立急性VMC動物模型，觀察病毒感染后心肌細胞p38MAPK通路的動態(tài)變化及其與VMC的關系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級近交系4～6周齡雄性Balb/C小鼠75只（上海斯萊克實驗動物有限責任公司）。

1.2 實驗試劑 CVB3病毒Nancy標準株（山東省醫(yī)學科學院病毒室）；兔抗鼠磷酸化p38MAPK單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（美國CST公司）。

1.3 模型制作及分組 75只小鼠隨機分成2組：心肌炎組60只和對照組15只，定病毒接種日為第0天，心肌炎組小鼠于第0天接種0.1 mL TCID50為10-5.33/mL的CVB3復制心肌炎動物模型[3]，對照組小鼠于相同時間點接種不含病毒液的1640培養(yǎng)液0.1 mL。病毒接種后第1、3、7、14天心肌炎組隨機抽取8只小鼠（病程中死亡的小鼠均剔除），對照組第14天取全部作為總體對照，眼球采血后頸椎脫臼法處死并留取血清及心臟標本，部分心肌組織于-80 ℃超低溫冰箱中保存，部分4%中性多聚甲醛固定。

1.4 心肌炎癥積分測定 小鼠心肌組織常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色后光鏡下（200倍）觀察心肌的病理改變。每張切片隨機取5個視野，計算每個視野區(qū)域炎癥細胞浸潤及壞死區(qū)域面積與整個視野的面積之比：無病變0分，≤25%計1分，≤50%計2分，≤75%計3分，＞75%計4分。

1.5 心肌肌鈣蛋白（cTn-I）測定 采用Beckman全自動生化分析系統(tǒng)（美國）進行化學發(fā)光免疫法。

1.6 心肌組織磷酸化p38MAPK含量檢測 采用蛋白免疫印跡（Western-blot）法。

1.7 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件。所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，計量資料用±s表示。組間比較采用單因素方差分析，方差齊性者采用LSD法，方差不齊者進行Dunnet’s T3檢驗。兩變量相關用直線相關法分析。

2 結果

2.1 VMC小鼠發(fā)病及死亡情況 心肌炎小鼠在病毒接種后第3天出現(xiàn)活動、進食減少，部分出現(xiàn)腹瀉，逐漸出現(xiàn)聳毛、蜷縮現(xiàn)象，興奮性先增高后逐漸進入抑制狀態(tài)。于第4天出現(xiàn)死亡，死亡高峰為病毒接種后第8天，整個病程中共死亡21只。對照小鼠整個實驗過程中無死亡，毛色光滑，活動、進食正常，體重增加。

2.2 VMC小鼠心肌組織病理改變及炎癥積分比較對照組小鼠心肌組織無炎癥細胞浸潤，心肌纖維排列整齊，胞漿豐富均勻，橫紋清晰，間質無水腫（見圖1）。心肌炎組小鼠感染CVB3后第1天，心肌組織內也未見明顯炎癥細胞浸潤；第3天，心包膜下、心肌細胞之間及心肌內的小血管周圍開始出現(xiàn)少量炎癥細胞浸潤（見圖2），炎癥積分開始升高。第7天，出現(xiàn)大面積心肌纖維壞死崩解，周圍有大量炎癥細胞浸潤（見圖3），炎癥積分達峰值。第14天炎癥細胞浸潤較第7天明顯減輕，但炎癥積分仍高于對照組水平（P<0.01），甚至殘留小片狀壞死（見圖4、表1）。

圖1 對照組小鼠心肌組織（HE，×200）

圖2 心肌炎組CVB3接種后第3天心肌組織（HE，×200）

圖3 心肌炎組CVB3接種后第7天心肌組織（HE，×200）

圖4 心肌炎組CVB3接種后第14天心肌組織（HE，×200）

表1 各時間點小鼠炎癥積分變化（±s，n＝8）

表1 各時間點小鼠炎癥積分變化（±s，n＝8）

與對照組比：**P<0.01

組別 第1天 第3天 第7天 第14天心肌炎組 0.000±0.000 1.025±0.185** 3.075±0.413** 1.150±0.212**對照組 0.000±0.000

2.3 VMC小鼠血清cTn-I含量變化 心肌炎組小鼠于病毒接種后第3天血清cTn-I含量開始逐漸升高，第7天達到高峰，然后漸下降，第14天較前明顯降低，但仍高于對照組水平（均P<0.01）（見表2）。

表2 各時間點小鼠cTn-I含量變化比較（ng/mL±s，n＝8）

表2 各時間點小鼠cTn-I含量變化比較（ng/mL±s，n＝8）

與對照組比：**P<0.01

組別 第1天 第3天 第7天 第14天心肌炎組 0.026±0.007 0.894±0.088** 17.415±0.772** 0.356±0.037﹡﹡對照組 0.013±0.009

2.4 各組小鼠心肌細胞磷酸化p38MAPK Westernblot結果 心肌炎組小鼠心肌細胞磷酸化p38MAPK含量呈先升高后下降的趨勢。CVB3感染后第1天，磷酸化p38MAPK含量即升高，第3天達峰值，第7天較前明顯下降但仍略高于對照組水平（P<0.01），第14天已恢復至對照組水平（見表3、圖5）。

表3 各時間點小鼠心肌細胞磷酸化p38MAPK Western-blot灰度值比較（±s，n＝3）

表3 各時間點小鼠心肌細胞磷酸化p38MAPK Western-blot灰度值比較（±s，n＝3）

與對照組比：*P<0.05，**P<0.01

組別 第1天 第3天 第7天 第14天心肌炎組 1.829±0.012** 2.618±0.098* 1.843±0.012** 1.566±0.031對照組 1.559±0.026

2.5 相關性分析 心肌組織磷酸化p38MAPK和血清cTn-I間存在正相關（r＝0.649，P＜0.01）。

3 討論

VMC是兒科常見的心血管感染性疾病，嚴重者可引起猝死，病程進展可發(fā)展為擴張性心肌病，預后差，已引起臨床的廣泛重視，其發(fā)病機制目前尚不清楚。本實驗觀察VMC急性期（病毒感染后14 d內），心肌細胞內磷酸化p38MAPK的動態(tài)變化，探討其可能的活化機制及在VMC發(fā)病中的作用。

p38MAPK是應激激活的MAPK信號通路之一，能被促炎細胞因子、應激刺激、G+細菌細胞壁成分等激活。p38MAPK被磷酸化激活后，由細胞漿轉入細胞核內，通過Fas、Bax、NF-κB等參與細胞凋亡、炎癥等過程[4]。研究表明p38MAPK信號通路和多種心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病有關。高血壓所致心肌肥厚、燒傷大鼠心肌收縮功能障礙和心肌細胞分泌炎性細胞因子、缺血所致的心肌損害及膿毒癥對心肌的損害等都和p38MAPK信號通路的活化有關[5-6]。

本實驗中，心肌炎組小鼠心肌細胞磷酸化p38MAPK從CVB3感染后第1天即開始增加，第3天達高峰，后逐漸下降至正常對照組水平，提示VMC中p38MAPK信號通路存在早期短暫活化。Berenbaum等[7]研究發(fā)現(xiàn)p38MAPK信號通路的活化常發(fā)生于疾病的早期，與本實驗結果相符。本實驗中p38MAPK通路活化發(fā)生于接種病毒后第0～3天，此期為病毒血癥期。Hirasawa等[3]研究發(fā)現(xiàn)，腦心肌炎病毒感染L929細胞后6～10 h即出現(xiàn)p38MAPK活化增加，且病毒蛋白也在感染后6 h開始測得并逐漸增加，給予p38MAPK特異性抑制劑后子代病毒蛋白合成減少，也與本實驗結果相符。因此我們推測早期活化的p38MAPK信號通路可能參與病毒與靶細胞受體的結合與復制。另外，相關分析顯示p38MAPK含量與血清cTn-I存在正相關（r＝0.649），在病毒感染的成纖維細胞中發(fā)現(xiàn)p38MAPK信號通路活化，并和炎癥因子IL-6、IL-1β產生有關[8]，推測p38MAPK還可能參與炎癥因子介導的心肌細胞損傷。但p38MAPK通路活化早于cTn-I升高及炎癥細胞浸潤出現(xiàn)的時間，并未隨著炎癥浸潤的加重而活化增加，心肌細胞磷酸化p38MAPK和炎癥積分沒有相關性（P=0.300），考慮磷酸化p38MAPK并非來源于炎癥細胞，心肌細胞本身可產生磷酸化p38MAPK，p38MAPK活化后轉位進入細胞核，調控核因子轉錄功能，參與多種基因的表達，是其發(fā)揮生物學作用的重要方式。綜上所述，p38MAPK信號通路可能介導VMC小鼠心肌的炎癥反應、病毒與靶細胞的結合及復制，在VMC的發(fā)病過程中起重要作用。

[1] Dennert R,Crijns HJ,Heymans S,et al. Acute viral myocarditis[J]. Eur Heart J,2008,29(17):2073-2082.

[2] Zhang S,Weinheimer C,Courtois M,et al.The role of the Grb2 - p38 MAPK signaling pathway in cardiac hypertrophy and fibrosis[J]. J Clin Invest, 2003,111(6):833-841.

[3] 李岳春, 楊占秋. 科薩奇病毒B3致病毒性心肌炎動物模型的建立[J]. 溫州醫(yī)學院學報, 2007, 37(5):481-482.

[4] Gomez-lazaro M,Galindo MF, Concannon CG, et al.6-Hydroxydopamine activates the mitochondrial apoptosis pathway through p38 MAPK-mediated, p53-independent activation of Bax and PUMA[J].J Neurochen,2008,104(6):1599-1612.

[5] Olzinski AR,McCafferty TA,Zhao SQ,et al. Hypertensive target organ damage is attenuated by a p38 MAPK inhibitor:role of systemic blood pressure and endothelial protection[J].Cardiovasc Res,2005,66(1):170-178.

[6] 樂勝 ,馬中富 ,梁雁冰,等 .白介素-1β在膿毒癥小鼠心肌中的表達及p38MAPK的調控作用[J] .中華急診醫(yī)學雜志, 2005,14(12) :982-992 .

[7] Berenbaum F,Humbert L,Bereziat G,et al. Concomitant recruitment of ERK1/2 and p38 MAPK signalling pathway is required for activation of cytoplasmic phospholipase A2 via ATP in articular chondrocytes[J]. J Bio Chem,2003,278(16):13680-13687.

[8] Zampetaki A,Zhang ZY,Hu YH,et al. Biomechanical stress induces IL-6 expression in smooth muscle cells via Ras/Rac1-p38 MAPK-NF-κB signaling pathways[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005,288:H2946-H2954 .