陳曉紅 鄭陸 朱一力 李青南 王宏梅

1 首都體育學院（北京 100088） 2 廣東藥學院

運動與骨代謝密切相關，其效應表現(xiàn)為骨量（BMD、BMC）改變，以及在此基礎上的骨質增強或減弱。人體實驗證實，長期大負荷運動使女運動員出現(xiàn)月經周期紊亂，骨密度降低[1-3]，甚至產生應力性骨折[4，5]。動物實驗結果也發(fā)現(xiàn)，大負荷運動使大鼠出現(xiàn)動情周期抑制[6]，骨量下降[7]。但尚缺乏對于大負荷運動及過量運動致骨量降低機制的研究。本研究通過測定遞增負荷大鼠脛骨上段骨組織形態(tài)計量學指標，從組織學和細胞學水平闡釋過量負荷運動骨量降低的靜、動態(tài)變化特點，及其可能機制，為豐富骨質疏松的病理機制理論提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

3月齡未經交配的雌性SD大鼠154只，體重269.51 ± 12.51 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。分籠飼養(yǎng)，自由進食、飲水，以國家標準嚙齒類動物常規(guī)飼料喂養(yǎng)。環(huán)境溫度18～24℃，相對濕度45～55%，通風良好。

1.2 動物分組及訓練方案

實驗開始前所有大鼠進行一周的適應性訓練，將進行運動的大鼠分為8組，按照負荷設定標準分別進行2、4、6、8、9、11、13、15周的遞增負荷運動，每組 10 只（T2、T4、T6、T8、T9、T11、T13、T15）。同期設立與運動組相對應的對照組，每組8只（C2、C4、C6、C8、C9、C11、C13、C15）。10 只 3月齡大鼠設為基礎對照組（BC）。運動組大鼠采用杭州段氏PT2000型跑臺進行訓練，每周運動6天，休息1天。負荷設定參照Bedford[8]運動負荷標準和鄭陸等[6]建立的運動性動情周期紊亂動物模型的負荷標準。具體的負荷設定標準如表1。

表1 大鼠運動負荷的設定

1.3 骨骼前期處理及骨密度測定

按計劃將大鼠分批處死。處死前第13和14天腹部皮下各注射一次鹽酸四環(huán)素（25 mg/kg）；第3和4天頸部皮下各注射一次calcein（5 mg/kg）。大鼠以3%戊巴比妥鈉行腹腔麻醉（30 mg/kg體重）。以雙能X線骨密度掃描儀（lunar prodigy）測量大鼠全身骨密度（bone mineral density，BMD）。大鼠處死后，取右側脛骨，剔除軟組織，進行骨組織形態(tài)計量學測量。

1.4 骨組織形態(tài)計量學制樣

用慢速骨鋸（Bushler LTD，USA）將大鼠脛骨鋸為3段，取脛骨近心端，沿脛骨粗隆行冠狀面切開，暴露骨髓腔。經系列脫水、甲基丙烯酸甲酯不脫鈣骨包埋、硬組織切片機（LEICA RM2255）切片，以BIOQUENT圖像系統(tǒng)對骨切片進行形態(tài)觀察和分析計量。

1.5 統(tǒng)計學分析

使用Excel 2003建立數(shù)據(jù)庫，用SPSS for windows 11.0軟件處理，結果以平均數(shù)±標準差（mean ± SD）表示，以Independent-sample t Test對運動組及對照組大鼠的實驗數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗；并以One-way ANOVA對大鼠骨形態(tài)計量學參數(shù)進行組間差異比較。檢驗水準P = 0.05，P < 0.05為差異顯著，P < 0.01為差異非常顯著。

2 結果

2.1 大鼠全身骨密度

表2顯示，大鼠骨密度隨年齡增加呈升高趨勢，在訓練前半程各運動組（T2-9）骨密度亦有所增加，但T9-13各組骨密度值基本恒定，略低于同期對照組，但無顯著差異，至T15組顯著低于對照組（P <0.001）。

表2 大鼠骨密度變化（g/cm2）

2.2 脛骨上段松質骨形態(tài)計量學結果

2.2.1 靜態(tài)參數(shù)

表3 各組大鼠脛骨上段松質骨靜態(tài)參數(shù)比較

表3顯示，各對照組靜態(tài)參數(shù)%Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp之間無顯著性差異。各運動組大鼠%Tb.Ar呈微弱上升后急劇下降趨勢，峰值出現(xiàn)在T11周，T13和T15組均與同期對照有顯著性差異。Tb.Th與%Tb.Ar趨勢一致。Tb.N則隨運動時間增加持續(xù)下降，T15組為最低點，和C15組比較有顯著性差異。BC至T11組Tb.Sp值基本持平，但T13組及T15組明顯上升，與同期對照組相比分別增加36.81%和75.65%，并有統(tǒng)計學意義。

2.2.2 動態(tài)參數(shù)

表4顯示，各組大鼠脛骨上段動態(tài)參數(shù)（%L.Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV）的變化見表4，BC至C15組大鼠的%L.Pm波動較大，但各組間無顯著性差異；MAR漸趨下降，除C15與BC組之間有顯著性差異外，各對照組間無顯著性差異；BFR/BS和BFR/BV也呈波浪式下降，各組間亦無顯著性差異。

BC至T15各組%L.Pm的變化趨勢為先下降后上升，T11組降至最低點，并與同期對照組有顯著性差異。BC-T13各組的MAR持續(xù)下降，T13組最低（與BC相比下降33.10%），T15組略有回升，運動各組與同期對照組相比均無顯著性差異。BFR/BS、BFR/BV的變化趨勢較為一致，呈先下降后上升，T11組達最低點，T11和T15組的BFR/BV與同期對照相比有顯著性差異。

表4 各組大鼠脛骨上段松質骨動態(tài)參數(shù)比較

2.2.3 細胞參數(shù)

表5顯示，各對照組大鼠細胞參數(shù)Oc.N、Oc.Pm%隨月齡增加呈先降低后持平趨勢，C11組、C13組和C15組Oc.N、Oc.Pm%與BC組相比有顯著性差異；C4組Ob.N、Ob.Pm%在最高點，以后略下降。

BC組至T15組Oc.N、Oc.Pm%變化趨勢為先降后升，T11組達最低點并與同期對照組相比有顯著性差異。BC組至T11組Ob.N、Ob.Pm%大致持平，后明顯升高。

表5 各組大鼠脛骨上段松質骨細胞參數(shù)比較

3 討論

3.1 長期遞增負荷運動對大鼠骨密度的影響

從各組大鼠BMD均值可以看出，BMD隨年齡增長呈波浪式上升趨勢，說明本研究所選大鼠處于骨量上升階段。3月齡大鼠骨量尚未達到峰值[9]，隨著月齡增加，大鼠骨量在7～10月齡逐漸達到最大值[10]。T2～T9組大鼠BMD雖有所增加，但與相應對照組無顯著性差異。由于實驗所用大鼠處于生長發(fā)育期，其BMD升高可能系增齡和運動負荷綜合作用的結果。這或許意味著前9周的運動負荷對骨組織而言相對較低，對骨代謝的刺激效果較弱；另一種可能的解釋是，骨的重建過程相對較慢，運動所致骨量的變化亦需要較長時間方能顯現(xiàn)，9周運動訓練可能尚不足以引起骨量改變。運動訓練9周后，隨著運動負荷增加，大鼠BMD呈下降趨勢，至T15組與同期對照組有顯著差異（P < 0.001）?？梢姶笫蠊橇吭鲩L受長時間大負荷過量運動影響而受到抑制，其原因除與運動負荷本身有關外，機體內分泌紊亂、HPO軸受抑、雌激素水平低下等為重要原因[11]。

3.2 遞增負荷運動對大鼠脛骨上段松質骨骨形態(tài)

計量學指標的影響

3.2.1 遞增負荷運動對大鼠脛骨上段松質骨靜態(tài)參數(shù)的影響

本實驗中，各對照組大鼠%Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp無顯著性差異，其中%Tb.Ar最高點出現(xiàn)在5.5月齡左右，這與劉曉青等[12]的報道一致。由此可見，3～7月齡大鼠松質骨骨小梁總面積及骨結構變化不大，處于相對穩(wěn)定狀態(tài)。但同期結果顯示，大鼠全身BMD隨月齡增加有明顯增加趨勢，由此推測3～7月齡大鼠全身骨密度增加與松質骨骨小梁結構無關，可能來自于皮質骨改變，或者與松質骨中骨小梁鈣沉積量明顯增加有關。

各 運 動 組 大 鼠 %Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N和TB.Sp的變化趨勢不盡相同，但各指標變化的轉折點基本出現(xiàn)在運動11周前后。截止運動11周，運動組大鼠%Tb.Ar和Tb.Th呈緩慢升高趨勢，Tb.N呈緩慢降低趨勢，Tb.Sp水平幾乎恒定，各指標變化與同期對照組相比均無顯著差異。可見，前11周的運動訓練對大鼠脛骨上段骨小梁產生正性刺激作用，使%Tb.Ar小幅增加，其增加原因可能與骨小梁厚度（Tb.Th）增加有關，換言之，前11周的運動使大鼠脛骨上段骨小梁增粗增大，而數(shù)量略下降，骨小梁結構的這種變化特征可能是骨骼在運動負荷刺激下所產生的適應性變化。而此時大鼠全身BMD緩慢升高并維持在較高水平，與%Tb.Ar和Tb.Th的增加一致。但這些指標的增加幅度有限，其原因可能與這種閾值負荷下的良性刺激對大鼠骨骼的作用時間偏短（僅11周），效果尚未充分顯現(xiàn)有關。有理由推測，假若維持此運動負荷，延長運動訓練周期，骨量可能會明顯增加。

T13組和T15組大鼠%Tb.Ar明顯下降，與同期對照相比分別下降33.2%和48.6%，有顯著性差異；同時，Tb.Th、Tb.N均下降，Tb.Sp急劇升高，并與同期對照比較差異顯著。此與Bourrin等[13]的研究結果一致。由此可見，在遞增負荷運動下，T13組和T15組大鼠松質骨數(shù)量和骨結構陡然下降。于順祿等[14]認為，無論何種原因造成的骨質疏松，%Tb.Ar值如低于正常（或對照標準）的15%，就應視為骨質疏松癥。故T13組和T15組大鼠已出現(xiàn)明顯的骨質疏松。此外，T15組大鼠全身BMD亦顯著降低，說明持續(xù)的遞增負荷最終不僅導致大鼠松質骨骨小梁面積減小、骨結構變差，還使大鼠全身骨密度顯著降低，出現(xiàn)運動性骨量降低。值得注意的是，本實驗模型大鼠的骨組織形態(tài)學特點與去卵巢骨質疏松模型相似，大鼠去卵巢后，其松質骨骨小梁面積、數(shù)量減少，骨小梁分離度上升[9，15]。本研究中，運動組大鼠全身BMD降低的時間明顯滯后于骨組織形態(tài)計量學指標的變化，該結果與趙燁等[16]的研究一致，也進一步證實骨組織形態(tài)計量學技術作為一種先進的骨代謝評價手段，其早期、靈敏等特點有助于發(fā)現(xiàn)骨質的早期變化。

3.2.2 遞增負荷運動對大鼠脛骨上段松質骨動態(tài)參數(shù)及細胞參數(shù)的影響

動態(tài)參數(shù)反映骨表面礦化的量和速率，并可以解釋靜態(tài)參數(shù)變化的原因。本研究中，BC組至C15組大鼠%L.Pm呈先上升后下降趨勢，其中C4（4月齡）組最高，但各組間無顯著性差異；MAR、BFR/BS、BFR/BV均漸次降低，提示3～4月齡大鼠成骨細胞活性及骨形成率處于巔峰狀態(tài)，其原因是此階段大鼠脛骨上段的骨骺尚未閉合，血供和營養(yǎng)豐富，代謝功能活躍，骨的再生能力強，骨轉換率比較高[17]。隨著大鼠月齡的增加，其成骨活性及骨轉化率逐漸降低，至實驗結束時達最低點。同時，各對照組大鼠脛骨上段各項細胞參數(shù)亦發(fā)生相應變化，3～4月齡大鼠Oc.N、Oc.Pm%及Ob.N、Ob.Pm%高于其他月齡組，說明此月齡大鼠成骨細胞、破骨細胞數(shù)量和活性處于較高水平，骨代謝轉化率較高。而后隨著鼠齡增加，成骨細胞、破骨細胞數(shù)量和活性逐漸降低，骨形成和骨吸收均逐漸放緩，骨代謝轉化率下降，此結果與上述動態(tài)參數(shù)結果所表達的意義一致。結合脛骨上段靜態(tài)參數(shù)的變化可以發(fā)現(xiàn)，3～7月齡大鼠骨小梁形態(tài)和結構基本維持不變，骨形成和骨吸收均減弱，并處于動態(tài)平衡狀態(tài)，骨量保持穩(wěn)定[9]。

分析各運動組動態(tài)參數(shù)可以發(fā)現(xiàn)，BC組至T15組%L.Pm、BFR/BS、BFR/BV的變化趨勢均為先下降后上升，T11組達最低點；MAR呈持續(xù)下降趨勢，T13組達最低點，T15組略有回升。這表明動態(tài)參數(shù)變化的轉折點亦大致出現(xiàn)在T11組。BC組至T11組 的%L.Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV均 呈下降趨勢，說明大鼠脛骨上段成骨細胞和破骨細胞活性逐漸降低，骨形成和骨吸收同步受到抑制，骨代謝轉化率逐漸下降。值得注意的是，在整個運動訓練期間，運動組MAR與同期對照組比較無顯著性差異，由于礦化沉積率代表每天骨表面礦化的寬度，反映骨礦化的快慢，故推測在整個運動訓練期間，大鼠骨表面成骨細胞的礦化并未發(fā)生明顯變化。而各運動組Oc.N、Oc.Pm%及Ob.N、Ob.Pm%也逐漸下降，這從細胞水平證實，運動訓練前11周大鼠破骨細胞骨吸收和成骨細胞骨形成均受到一定程度的抑制。但分析BC組至T11組靜態(tài)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，前11周的運動訓練對骨小梁面積和結構略有正性刺激作用，使骨結構更趨合理，骨量增加。而在運動訓練的后半程（11～15周），代表骨形成的參數(shù)（%L.Pm、BFR/BS、BFR/BV、Ob.N、Ob.Pm%）和代表骨吸收的參數(shù)（Oc.N、Oc.Pm%）均有明顯回升，但代表骨小梁數(shù)量和結構的靜態(tài)參數(shù)（骨小梁面積百分比、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目、骨小梁分離度）出現(xiàn)負性改變，表明隨著運動負荷的增加，大鼠的骨吸收和骨形成均明顯增加，骨轉化率增加，骨吸收大于骨形成，骨量下降。這種特點與絕經期婦女的骨代謝狀態(tài)相似[15，18]，絕經后婦女有大量的骨重建單位參與骨的更新，骨更新率明顯加速，新骨形成速度比骨吸收慢，造成骨量快速、大量丟失。

綜上所述，15周遞增負荷運動訓練使大鼠全身BMD降低，脛骨上段骨形態(tài)計量學參數(shù)亦發(fā)生明顯變化，骨形成參數(shù)（%L.Pm、BFR/BS、BFR/BV、Ob.N、Ob.Pm%）和骨吸收的參數(shù)（Oc.N、Oc.Pm%）均呈現(xiàn)先下降后上升的“V”形變化，T11組達最低點，表明在遞增負荷運動11～15周，大鼠骨形成和骨吸收均加速；脛骨上段松質骨靜態(tài)參數(shù)亦發(fā)生明顯變化，骨小梁面積、數(shù)量及寬度均顯著下降，骨小梁分離度明顯升高，表明本研究的遞增負荷運動使骨代謝呈現(xiàn)高轉換狀態(tài)，且骨吸收大于骨形成，骨量下降。這種變化的可能機制為：大負荷運動抑制大鼠HPO軸[19]，降低卵巢激素水平[11]，出現(xiàn)類似于人類絕經后骨質疏松的骨代謝特征——骨形成和骨吸收均增強，骨吸收占主導地位，骨代謝狀態(tài)為高轉換型。

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