周義義 傅博 朱榮 溫州大學體育學院（溫州 505） 遼寧省足球運動管理中心 溫州醫(yī)學院

大強度運動可造成運動性免疫抑制，與運動誘導的淋巴細胞凋亡有關(guān)［1-3］。近年來，關(guān)于運動與免疫細胞凋亡的研究主要集中在不同運動強度對淋巴細胞凋亡的影響。研究表明，劇烈運動或力竭運動可顯著誘導淋巴細胞凋亡和DNA損傷［4］，而中等強度運動（65%～70%VO2max）對淋巴細胞凋亡的影響仍有爭議［5-7］。肌肉劇烈收縮易造成運動性肌肉損傷、延遲性肌肉酸痛和運動性疲勞［8］，也是造成運動性免疫抑制的重要誘因［9］，但機制未明。本研究以負重運動造成肌肉損傷為模型［10］，探討其對外周血淋巴細胞凋亡的影響并分析可能機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象

16名溫州體育運動學校的男子田徑運動員（二級）自愿參加本實驗，年齡（14.5±1.4）歲，身高（1.75±0.12）m，體重（67.8±4.6）kg，訓練年限（4.8±0.7）年。所有運動員身體健康，無心血管疾病、急慢性感染、骨關(guān)節(jié)疾病及其他疾病史，近期無服藥史，無吸煙、飲酒等不良嗜好。

1.2 運動方案與取血

受試者在實驗前72 h內(nèi)均無劇烈運動，實驗前一晚至少睡眠8 h。清晨空腹肘正中靜脈采血5 ml后休息15 min，然后進行一次急性負重離心運動。方案如下［10］：受試者采用背包負重，重量為各自體重的30%，先進行5 min臺階試驗（臺階高30 cm，登階頻率為54步/min，用節(jié)拍器控制），緊接著完成15次蹲起，3 s蹲下，2 s站起（延長離心收縮時間）。運動后即刻和運動后2 h、4 h、8 h、12 h、24 h和48 h靜脈采血5 ml，EDTA抗凝。

1.3 血清CK和皮質(zhì)醇

取抗凝血離心分離血清，使用試劑盒（南京建成生物工程研究所）并嚴格按照操作說明進行。測試儀器：血清CK使用MD-100半自動生化分析儀（美國伯明斯頓公司）測定，血清皮質(zhì)醇使用FMQ-9013C型γ放免分析儀（唐山市晨曦電子有限公司）測定。

1.4 淋巴細胞的分離

取新鮮肝素鈉抗凝血3 ml，加入0.375 ml淋巴細胞分離液，混勻，800g室溫離心30 min，取出白色絨毛狀的淋巴細胞層，即外周血單個核細胞，用RPMI1640液洗滌，400g離心10 min，棄上清，用含10% 胎牛血清的RPMI1640液重懸細胞，置入培養(yǎng)皿，調(diào)細胞密度5×108～1×109/L。利用單核細胞貼壁特性，取非貼壁細胞懸液少許，經(jīng)瑞氏染色后油鏡下檢測形態(tài)，證實為淋巴細胞。

1.5 淋巴細胞凋亡率

用冷PBS調(diào)至淋巴細胞為5×108~1×109/L，加入0.8 ml含RNase的碘化丙啶（PI），4℃避光15 min。FACS 420流式細胞儀（美國BD公司）檢測淋巴細胞凋亡率。

1.6 淋巴細胞Bax/Bcl-2和Fas/FasL的表達

淋巴細胞裂解后用考馬斯亮藍法測定蛋白含量，蛋白樣品經(jīng)15% SDS-PAGE分離轉(zhuǎn)移于PVDF膜。一抗（美國Santacruz公司）孵育過夜，HRP標記二抗（天津TBD公司）孵育1小時，ECL顯影。采用凝膠系統(tǒng)分析軟件掃描各條帶灰度值，以對照組運動前條帶為100%，其它各條帶與其比值，即其相對表達量（%），actin為內(nèi)參蛋白。

1.7 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件包進行處理，結(jié)果用平均數(shù)±標準差表示，各組比較采用單因素方差分析，P < 0.05為顯著性水平，P < 0.01為非常顯著水平。

2 結(jié)果

表1顯示，淋巴細胞凋亡率在運動后呈先上升后下降的變化趨勢，運動后24 h達峰值，其中運動后即刻和運動后2 h、4 h、8 h、12 h、24 h和48 h均較運動前顯著性升高（均為P < 0.01），運動后48 h較運動后24 h顯著性下降（P < 0.01）；血清CK和Bax/Bcl-2亦呈先升高后下降的并行性變化趨勢，其中運動后12 h、24 h和48 h均較運動前顯著性升高（均為P < 0.01），運動后24 h達峰值，運動后48 h較運動后24 h顯著性下降（P < 0.01；P < 0.05）；Fas/FasL在各時間點均無顯著性變化（P> 0.05）；血清皮質(zhì)醇在運動后即刻、運動后2 h、4 h、8 h、12 h均較運動前顯著性升高（均為P < 0.01），運動后12 h達峰值，運動后24 h恢復至運動前水平（P > 0.05）。

表1 淋巴細胞凋亡率、血清CK、皮質(zhì)醇、Fas/FasL、Bax/Bcl-2的時程變化

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，一次急性負重運動后外周血淋巴細胞凋亡率在運動后即刻開始升高，24 h達峰值，48 h開始下降但仍高于運動前水平。Tuan等［11］發(fā)現(xiàn)，30 min大強度運動后淋巴細胞凋亡率顯著升高并一直持續(xù)到運動后72 h，與本研究的結(jié)果相似。這提示大強度不習慣的離心運動可誘導淋巴細胞凋亡增加并持續(xù)數(shù)天，因此可能是運動性免疫抑制發(fā)生的原因之一。

肌肉進行大強度運動（特別是離心運動）易發(fā)生運動性肌肉損傷，可能與肌細胞受到強烈的機械牽拉以及胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的變化有關(guān)［12］。肌細胞的機械牽拉（機械性損傷）可使Z盤斷裂、肌節(jié)降解，局部組織損傷以及膜通透性增高；劇烈運動造成肌細胞的能量耗竭（代謝性損傷），胞內(nèi)鈣離子濃度升高并激活鈣依賴的蛋白激酶，破壞骨架蛋白（肌節(jié)），同時激活鉀離子通道使膜電阻下降，通透性增高。肌肉損傷后，細胞內(nèi)容物透過肌膜漏出入血，造成血中非功能蛋白升高，其中血清CK是肌肉損傷的特異標志物［13］。本研究以負重運動為干預模型，其肌肉收縮的方式以離心運動為主（也包括向心運動），運動后12 h血清CK顯著升高，24 h達峰值，48 h開始下降，但仍高于運動前，這與Heled等［10］的研究結(jié)果一致，提示一次急性負重運動造成的肌肉損傷可持續(xù)2～3天，并發(fā)生肌纖維降解現(xiàn)象［14］。研究表明，運動后數(shù)天發(fā)生的繼發(fā)性肌肉降解可能與單核細胞釋放自由基有關(guān)［15］。肌肉進行急性運動時產(chǎn)生大量自由基，不僅與運動時細胞的無氧代謝有關(guān)，而且與免疫細胞的吞噬作用造成的繼發(fā)性炎癥反應關(guān)系密切［15］。此外，損傷的肌細胞內(nèi)容物外漏入血并刺激循環(huán)中的淋巴細胞產(chǎn)生自由基的增多（氧化應激），進而導致淋巴細胞凋亡增加［15，16］。結(jié)合本研究中CK與淋巴細胞凋亡率的變化，推測一次急性負重運動后12～24 h肌肉產(chǎn)生的損傷性變化參與了對該時期淋巴細胞凋亡的調(diào)控。

細胞凋亡的途徑包括死亡受體介導的信號通路和線粒體介導的信號通路。死亡受體介導的信號通路是通過Fas和Fas配體（FasL）結(jié)合而啟動凋亡［17］。Ostrowski等［18］的研究指出，大強度運動導致肌肉釋放促炎癥因子如TNF-α、IL-6、IL-1β等，可引發(fā)死亡受體介導的凋亡信號通路。由于本研究中Fas和FasL在各時間點均無變化，因此不支持上述結(jié)論，可能與實驗模型（運動強度、運動時間等）有關(guān)。線粒體介導的信號通路是通過Bcl-2超家族蛋白的表達實現(xiàn)的［19］。Bax是促凋亡因子，在體內(nèi)形成同二聚體，改變線粒體膜電位，增加線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，促進細胞色素C等物質(zhì)進入胞漿，激活Caspase，引起細胞凋亡［20］；而Bcl-2表達上調(diào)可使細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽（GSH）增加［21］，清除自由基，保護細胞免受氧化應激損傷并抑制細胞凋亡發(fā)生［22］。因此，Bcl-2和Bax是通過改變氧化應激水平調(diào)節(jié)細胞凋亡的［23］。研究表明，單獨Bax或Bcl-2的變化并不能完全代表細胞凋亡命運，Simon等［24］的研究證實，Bax/Bcl-2比值的變化決定了細胞凋亡或存活。在本研究中，Bax/Bcl-2在運動后12 h顯著升高，24 h達峰值，48 h仍高于運動前水平，說明負重運動誘導的淋巴細胞凋亡主要是通過線粒體介導的信號途徑實現(xiàn)的。另外，Bax/Bcl-2的變化與血清CK基本一致，進一步提示負重運動導致的肌肉損傷可能參與了外周血淋巴細胞凋亡的增加。研究表明，損傷的肌細胞內(nèi)容物外漏入血并刺激循環(huán)中的吞噬細胞產(chǎn)生ROS和活性氮［25］，此外，運動時肌肉產(chǎn)生的ROS隨著肌肉損傷而釋放入血［26］。自由基的增多（氧化應激）啟動了胞漿的信號鏈式反應，導致p53蛋白磷酸化，從而升高Bax并降低Bcl-2［27］，改變了細胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白之間的穩(wěn)態(tài)平衡，破壞線粒體膜電位和DNA結(jié)構(gòu)，引發(fā)線粒體介導的凋亡信號通路［28］。

本研究中，淋巴細胞凋亡率在運動后即刻至運動后48 h均顯著升高，而血清CK和Bax/Bcl-2在運動后12 h才顯著升高，提示其他因素參與了淋巴細胞的早期凋亡。細胞培養(yǎng)實驗證實，皮質(zhì)醇（糖皮質(zhì)激素）可誘導外周血淋巴細胞凋亡［29］。本研究發(fā)現(xiàn)，血清皮質(zhì)醇在一次急性負重運動后即刻顯著升高，12 h達峰值，24～48 h恢復至運動前水平，這與Kruger等［30］的最新研究一致，他們發(fā)現(xiàn)，一次大強度抗阻訓練后血清皮質(zhì)醇顯著升高，24 h恢復，并證實大強度抗阻訓練誘導的淋巴細胞凋亡是通過糖皮質(zhì)激素受體途徑介導的。因此，本研究的結(jié)果提示，皮質(zhì)醇的升高參與了負重運動誘導的淋巴細胞早期凋亡。

4 總結(jié)

負重運動可誘導外周血淋巴細胞凋亡，其機制與運動性肌肉損傷、應激激素（皮質(zhì)醇）升高和線粒體氧化應激有關(guān)。

［1］Mooren FC，Bloming D，Lechtermann A，et al. Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise.J Appl Physiol，2002，93（1）：147-153.

［2］Ekblom B，Ekblom O，Malm C. Infectious episodes before and after a marathon race. Scand J Med Sci Sports，2006，16（4）：287-293.

［3］ 唐暉，周亮，姚績偉，等. 運動性免疫抑制的研究進展.武漢體育學院學報，2008，42（4）：75-81.

［4］Navalta JW，Sedlock DA，Park KS，et al. Neither gender nor menstrual cycle phase infl uences exercise-induced lymphocyte apoptosis in untrained subjects. Appl Physiol Nutr Metab，2007，32（3）：481-486.

［5］Wang JS，Huang YH. Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men.Eur J Appl Physiol，2005，95（4）：290-297.

［6］Peters EM，Van Eden M，Tyler N，et al. Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes. Eur J Appl Physiol，2006，98（2）：124-131.

［7］Navalta JW，McFarlin BK，Lyons TS. Does exercise really induce lymphocyte apoptosis? Front Biosci（ Elite Ed），2010，2：478-488.

［8］Hubal MJ，Devaney JM，Hoffman EP，et al. CCL2 and CCR2 polymorphisms are associated with markers of exercise-induced skeletal muscle damage. J Appl Physiol，2010，108（6）：1651-1658.

［9］Pedersen BK，Bruunsgaard H，Klokker M，et al.Exercise-induced immunomodulation--possible roles of neuroendocrine and metabolic factors. Int J Sports Med，1997，18（Suppl 1）：S2-7.

［10］Heled Y，Bloom MS，Wu TJ，et al. CK-MMand ACE genotypes and physiological prediction of the creatine kinase response to exercise. J Appl Physiol，2007，103（2）：504-510.

［11］Tuan TC，Hsu TG，F(xiàn)ong MC，et al. Deleterious effects of short-term，high-intensity exercise on immune function：evidence from leucocyte mitochondrial alterations and apoptosis. Br J Sports Med，2008，42（1）：11-15

［12］Brancaccio P，Lippi G，Maffulli N. Biochemical markers of muscular damage. Clin Chem Lab Med，2010，48（6）：757-767.

［13］Cervellin G，Comelli I，Lippi G. Rhabdomyolysis：historical background，clinical，diagnostic and therapeutic features. Clin Chem Lab Med，2010，48（6）：749-756.

［14］Radak Z，Pucsok J，Mecseki S，et al. Muscle sorenessinduced reduction in force generation is accompanied by increased nitric oxide content and DNA damage in human skeletal muscle. Free Radic Biol Med，1999，26（7-8）：1059-1063.

［15］Kruger K，F(xiàn)rost S，Most E，et al. Exercise affects tissue lymphocyte apoptosis via redox-sensitive and Fasdependent signaling pathways. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2009，296（5）：R1518-1527.

［16］陳佩杰，董靜梅. 過度運動激活中性粒細胞產(chǎn)生的活性氧對淋巴細胞DNA損傷及干預研究. 體育科學，2011，31（1）：29-38.

［17］張丹英，雷艷霞，趙俊杰，等. 低硒碘處理大鼠肝臟某些生化指標和凋亡蛋白（Fas/FasL）表達的變化.衛(wèi)生研究，2008，37（6）：682-684.

［18］Ostrowski K，Rohde T，Asp S，et al. Pro- and antiinflammatory cytokine balance in strenuous exercise in humans. J Physiol，1999，515（Pt 1）：287-291.

［19］Skommer J，Brittain T，Raychaudhuri S. Bcl-2 inhibits apoptosis by increasing the time-to-death and intrinsic cell-to-cell variations in the mitochondrial pathway of cell death. Apoptosis，2010，15（10）：1223-1233.

［20］Oltvai ZN，Milliman CL，Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog，Bax，that accelerates programmed cell death. Cell，1993，74（4）：609-619.

［21］Mirkovic N，Voehringer DW，Story MD，et al. Resistance to radiation-induced apoptosis in Bcl-2-expressing cells is reversed by depleting cellular thiols. Oncogene，1997，15（12）：1461-1470.

［22］McCullough KD，Martindale JL，Klotz LO，et al.Gadd153 sensitizes cells to endoplasmic reticulum stress by down-regulating Bcl2 and perturbing the cellular redox state. Mol Cell Biol，2001，21（4）：1249-1259.

［23］Li WJ，Shin MK，Oh SJ. Time dependent bladder apoptosis induced by acute bladder outlet obstruction and subsequent emptying is associated with decreased Mn-SOD expression and Bcl-2/Bax ratio. J Korean Med Sci，2010，25（11）：1652-1656.

［24］Simon HU. Regulation of eosinophil and neutrophil apoptosis--similarities and differences. Immunol Rev，2001，179：156-162.

［25］Lundqvist-Gustafsson H，Bengtsson T. Activation of the granule pool of the NADPH oxidase accelerates apoptosis in human neutrophils. J Leukoc Biol，1999，65（2）：196-204.

［26］Tidball JG. Interactions between muscle and the immune system during modifi ed musculoskeletal loading. Clin Orthop Relat Res，2002，（403 Suppl）：S100-109.

［27］El-Domyati M，Barakat M，Abdel-Razek R，et al.Apoptosis，P53 and Bcl-2 expression in response to topical calcipotriol therapy for psoriasis. Int J Dermatol，2007，46（5）：468-474.

［28］Sawai H，Domae N. Release of cytochrome c from mitochondria precedes Bax translocation/activation in Triton X-100-induced apoptosis. Leuk Res，2008，32（3）：445-453.

［29］Hoffman-Goetz L，Zajchowski S. In vitro apoptosis of lymphocytes after exposure to levels of corticosterone observed following submaximal exercise. J Sports Med Phys Fitness，1999，39（4）：269-274.

［30］Kruger K，Agnischock S，Lechtermann A，et al. Intensive resistance exercise induces lymphocyte apoptosis via cortisol and glucocorticoid-receptor dependent pathways.J Appl Physiol，2011[Epub ahead of print]