于曉芳，張忠平

(山東誠創(chuàng)醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司，山東 濟(jì)南 250101)

蛋白多肽藥物是一類具有生物活性的大分子物質(zhì)，尋求準(zhǔn)確、靈敏、高效和簡便的分析方法研究這類物質(zhì)一直是藥物分析者的研究重點(diǎn)。毛細(xì)管電泳(Capillary Electrophoresis，CE)又稱高效毛細(xì)管電泳，被譽(yù)為是20世紀(jì)90年代最為重要的分離分析方法之一，已成為某些藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中常規(guī)的分析方法。近年來它在生物大分子(尤其是蛋白多肽)的分離分析和應(yīng)用研究方面已經(jīng)取得了長足的進(jìn)展，各種分離模式和檢測技術(shù)的應(yīng)用、柱上富集技術(shù)以及與其它方法的聯(lián)用技術(shù)，使毛細(xì)管電泳法在研究復(fù)雜體系或痕量組分方面成為強(qiáng)有力的分析手段。

近10年來，國內(nèi)外有關(guān)毛細(xì)管電泳技術(shù)的文獻(xiàn)相繼發(fā)表，毛細(xì)管電泳的研究呈明顯上升趨勢，其中，蛋白多肽的研究占有較大比重。本文綜述了毛細(xì)管電泳在蛋白多肽藥物分析中的應(yīng)用。

1 毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳是以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分在毛細(xì)管中分配行為和淌度的差異而進(jìn)行高效、快速分離的一種新型的液相分離分析技術(shù)。

1.1 毛細(xì)管電泳的類型 為了適應(yīng)不同分析對象的要求，分析科學(xué)家已經(jīng)開發(fā)出多種毛細(xì)管電泳分離模式，使毛細(xì)管電泳技術(shù)不斷趨于完善和成熟，它們各具特色，成為毛細(xì)管電泳技術(shù)重要組成部分。主要包括毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)、毛細(xì)管膠束電動色譜(MEKC)、毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)、毛細(xì)管等電聚焦電泳(CIEF)、毛細(xì)管等速電泳(CITP)、毛細(xì)管電色譜(CEC)、親和毛細(xì)管電泳(ACE)、非水毛細(xì)管電泳(NACE)、芯片毛細(xì)管電泳(MCCE)、毛細(xì)管陣列電泳(CAE)等。

1.2 毛細(xì)管電泳的特點(diǎn) 毛細(xì)管電泳技術(shù)兼有高壓電泳及高效液相色譜的優(yōu)點(diǎn)，其突出特點(diǎn)表現(xiàn)在以下幾個方面:所需樣品量少、儀器自動化程度高、操作簡便;分析速度快，分離效率高，分辨率高;操作模式多，開發(fā)分析方法容易;實(shí)驗(yàn)成本低，消耗少，應(yīng)用范圍極廣;另外毛細(xì)管電泳彌補(bǔ)了HPLC在低波長下定量測定的不足。

毛細(xì)管電泳也存在不足之處。首先它不能像HPLC一樣可用于制備分離。其次無論哪種分離模式都存在毛細(xì)管對蛋白質(zhì)的吸附所導(dǎo)致的電泳遷移時間重現(xiàn)性差和精密度不高等問題，由進(jìn)樣量精密度不高導(dǎo)致的峰面積大小不穩(wěn)定和定量不準(zhǔn)確等問題。

1.3 毛細(xì)管電泳的發(fā)展方向 目前，毛細(xì)管電泳的發(fā)展方向主要有兩個方面。第一是毛細(xì)管電泳的應(yīng)用研究，主要集中在蛋白質(zhì)、多肽分離、DNA測定、手性分離、糖型分析等分析領(lǐng)域。由于毛細(xì)管電泳在結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)、多肽分離中顯示了獨(dú)特優(yōu)勢，目前在這一領(lǐng)域的研究十分活躍。第二是毛細(xì)管電泳方法本身的完善和儀器發(fā)展，主要以建立新的分離模式、聯(lián)用技術(shù)以及克服自身方法不足為重點(diǎn)。重現(xiàn)性、速度和檢測靈敏度的提高，將使越來越多的制藥企業(yè)開始使用毛細(xì)管電泳，而不是僅停留在基礎(chǔ)研究階段。

2 毛細(xì)管電泳在蛋白多肽藥物分析中的應(yīng)用

蛋白多肽的分離分析是CE技術(shù)最早的應(yīng)用之一。1981年Jorgenson和Lukacs［1］使用75 μm毛細(xì)管進(jìn)行區(qū)帶電泳分析丹?；被釙r，發(fā)現(xiàn)毛細(xì)管的分離柱效與電場強(qiáng)度成正比(N∝E)，與溶質(zhì)分子的擴(kuò)散系數(shù)成反比(N∝D－1)，而蛋白質(zhì)和多肽具有擴(kuò)散系數(shù)小的特點(diǎn)，因此理論上毛細(xì)管電泳非常適合于蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的分析研究。

2.1 蛋白多肽藥物的分離研究 毛細(xì)管電泳對蛋白多肽藥物的分離尤其是結(jié)構(gòu)相似的蛋白多肽藥物的分離是對其進(jìn)行分析研究的基礎(chǔ)。CE分離原理不同于HPLC，它是依據(jù)樣品中各組分在毛細(xì)管中分配行為和淌度的差異而進(jìn)行分離，分離效率高，在蛋白多肽藥物分離中顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢。

Wielgos和 Somsen 等［2，3］分別采用了高濃度的緩沖液(600 mM 的磷酸鹽pH3.5，850 mM 的Tris緩沖液pH 3.0)以及25 μm內(nèi)徑的毛細(xì)管柱，將肝素鈉和多硫酸軟骨素和硫酸皮膚素分離。目前國內(nèi)采用的方法只能將前兩者分離，并且分離度不高，用于鑒別肝素鈉中是否含有多硫酸軟骨素;另外有文獻(xiàn)報道采用CZE法分析抑肽酶中去丙氨酸－抑肽酶(抑肽酶C端脫去一個丙氨酸)和去丙氨酸－去甘氨酸－抑肽酶(抑肽酶C端脫去一個丙氨酸和一個甘氨酸)，它們相對與抑肽酶的保留時間僅為0.98和0.99，這樣小的差異在HPLC上幾乎不可能達(dá)分離。

2.2 蛋白多肽藥物的純度鑒定 對蛋白多肽藥物的純度鑒定是毛細(xì)管電泳法的又一應(yīng)用。由于生物藥品所特有的復(fù)雜性和質(zhì)量要求的嚴(yán)格性，其純度鑒定需要更加強(qiáng)有力的分析手段。常用的純度鑒定方法有凝膠電泳和HPLC法，但是CE具有更高的分辨率和靈敏度，上樣量更少，僅為納升級，非常適合于珍貴的蛋白質(zhì)樣品的分析。

Pessi等［4］研究發(fā)現(xiàn)，純化的多抗原肽在凝膠電泳和HPLC上純度為100%，但是在HPCE分析時純度僅為90%;Catai等［5］采用雙涂層毛細(xì)管柱分析重組人生長激素(hGH)的純度，將hGH與其脫氨產(chǎn)物、剪切產(chǎn)物、18位氨基酸Gln突變產(chǎn)物有效分離。

2.3 蛋白多肽藥物的性質(zhì)研究 毛細(xì)管電泳對蛋白多肽藥物的性質(zhì)研究主要包括:等電點(diǎn)測定、分子量測定和穩(wěn)定性研究等。

應(yīng)用CIEF技術(shù)可以準(zhǔn)確測定蛋白多肽的等電點(diǎn)。原理是先對一系列已知等電點(diǎn)的蛋白進(jìn)行電泳，得到一條以等電點(diǎn)值為縱坐標(biāo)，相對遷移值為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后對樣品進(jìn)行電泳測定相對遷移值求其等電點(diǎn)。傳統(tǒng)的凝膠等電聚焦毛細(xì)管電泳需要先將蛋白在毛細(xì)管內(nèi)聚焦，聚焦完成后將蛋白遷移至毛細(xì)管檢測窗口端進(jìn)行檢測。遷移過程中容易導(dǎo)致pH梯度扭曲，從而使區(qū)帶展寬、分離度下降、重現(xiàn)性差;文獻(xiàn)報道了加拿大的 Convergent Bioscience公司的iCE280毛細(xì)管等電聚焦電泳儀測定免疫球蛋白(糖基化)、重組人生長激素－健豪寧(非糖基化)、生長激素抑制劑－somavert(PEG化)的等電點(diǎn)。iCE280采用全透明的毛細(xì)管柱，電泳過程中沒有蛋白聚焦完成后的遷移過程，并且對聚焦過程實(shí)時檢測，方法優(yōu)化簡單、分辨率高、重現(xiàn)性好。

毛細(xì)管SDS－凝膠電泳可以對蛋白多肽分子量進(jìn)行測定。廖海明等使用了葡聚糖為分離介質(zhì)，線性聚丙烯酰胺涂漬毛細(xì)管柱為支持介質(zhì)，測定了15種蛋白質(zhì)的分子量，并與平板SDS－聚丙烯酰胺膠電泳(SDS－PAGE)測定的結(jié)果進(jìn)行了比較，兩種方法的結(jié)果具有良好的一致性。

2.4 蛋白多肽藥物的結(jié)構(gòu)分析 蛋白多肽藥物的肽譜結(jié)構(gòu)分析，這需要先將蛋白質(zhì)、多肽酶解，然后用CE分離獲得“指紋圖譜”，以提供蛋白質(zhì)及多肽的結(jié)構(gòu)信息。Schuchert－Shi等［6］利用非接觸電導(dǎo)檢測器CE對胃蛋白酶和胰蛋白酶降解的細(xì)胞色素C、人血清白蛋白、牛血清白蛋白等產(chǎn)物進(jìn)行分析，將降解的肽段和氨基酸碎片成功分離并檢測;Busnel等采用了含兩性電解質(zhì)載體的電泳緩沖液以及ESI－MS檢測器對胰蛋白酶降解的細(xì)胞色素C、β－乳球蛋白和鐵傳遞蛋白產(chǎn)物進(jìn)行了分離。

2.5 蛋白多肽藥物的藥代動力學(xué)研究 蛋白多肽藥物的藥代動力學(xué)是藥代動力學(xué)研究中的難點(diǎn)之一。毛細(xì)管電泳具有高的分辨率和靈敏度，在用于進(jìn)入人體內(nèi)的蛋白多肽藥物的吸收、分布、排泄等研究方面，即臨床藥物分析中顯示了它獨(dú)特的優(yōu)勢。

Guzman等綜述了親和毛細(xì)管電泳(immunoaffinity capillary electrophoresis，IACE)用于生物基質(zhì)中低濃度的生物標(biāo)志物、蛋白藥物以及代謝產(chǎn)物的檢測。親和免疫原理同抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，其生物選擇性吸附機(jī)制以及將被分析樣品富集，使之具有更高的選擇性和靈敏度，滿足藥代動力學(xué)的測定要求。

3 毛細(xì)管電泳在各國藥典中的應(yīng)用

《中國藥典》在2000年版(二部)的附錄色譜法中，第一次收錄了毛細(xì)管電泳法，2005年版對方法進(jìn)行了進(jìn)一步的補(bǔ)充，但是暫無具體的藥物品種在鑒別、檢查、含量測定項(xiàng)下采用毛細(xì)管電泳的方法。

《英國藥典》(BP)在2000年版附錄中第一次收錄了毛細(xì)管電泳法。BP(2009)中，現(xiàn)已有7個品種應(yīng)用了毛細(xì)管電泳方法，如谷胱甘肽有關(guān)物質(zhì)的測定采用了CZE方法?！稓W洲藥典》(EP)在2001年第3版附錄中第一次收錄毛細(xì)管電泳。EP(6.0)版本中收錄了除BP(2009)中7個品種外，還在Erythropoietin concentrated solution(EPO，促紅細(xì)胞生成素)中的鑒別項(xiàng)下采用了CZE方法。

《美國藥典》(USP)24版的第二增補(bǔ)本中收錄了毛細(xì)管電泳法，詳細(xì)地介紹了它的定義、分類、基本原理、儀器構(gòu)造及其操作參數(shù)。USP(32)中收錄了4個品種采用毛細(xì)管電泳法，如肝素鈉的鑒別采用了CZE方法。

4 展望

毛細(xì)管電泳法的特點(diǎn)是樣品和緩沖液用量少、分離快速高效、有多種分離模式以適用于不同的分離對象，它已成為研究蛋白多肽藥物最具吸引力的工具之一。隨著毛細(xì)管電泳儀器和方法的不斷發(fā)展完善，逐步提高進(jìn)樣精密度，解決毛細(xì)管內(nèi)壁對蛋白質(zhì)的吸附等問題，從而提高電泳遷移時間的重復(fù)性和定量的準(zhǔn)確性，將會有越來越多的藥品應(yīng)用毛細(xì)管電泳來進(jìn)行分析研究。

［1］Jorgenson J W，Lukacs K D.Zone electrophoresis in open－ tubular glass capillaries.Anal Chem，1981，53(8):1298－1302.

［2］Wielgos T，Havel K，Ivanova N，et al.Determination of impurities in heparin by capillary electrophoresis using high molarity phosphate buffers［J］.J Pharm Biomed Anal，2009，49(2):319 －326.

［3］Somsen GW，Tak Y，Torano J，et al.Determination of oversulfated chondroitin sulfate and dermatan sulfate impurities in heparin by capillary electrophoresis［J］.J Chromatogr A，2009，1216:4107 －4112.

［4］Pessi A，Bianchi E，Chuappinelli L，et al.Applicaiton of capillary zone electrophoresis to the characterization of multiple antigen peptides［J］.J Chromatogr A，1991，557(1－2):307－313.

［5］Catai J，Torano J，Jongen P，et al.Analysis of recombination human growth hormone by capillary electrophoresis with bilayer－coated capillaries using UV and MS detection［J］.J Chromatogr B，2007，852(1 －2):160 －166.

［6］Schuchert－Shi A，Hauser P.Peptic and tryptic digestion of peptides and proteins monitored by capillary electrophoresis with contactless conductivity detection［J］.Anal Biochem，2009，387(2):202 －207.