何秀麗，孟菲，周妍妍，謝寧

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

老年性癡呆(Alzheimer＇s disease，AD)，是發(fā)生于老年前期或老年期的大腦退行性疾病，因腦內(nèi)細(xì)胞外β－淀粉樣蛋白(β－amyloid，Aβ)沉積形成的神經(jīng)炎性斑，是其特征性的病理變化;以慢性進(jìn)行性不可逆的記憶減退、認(rèn)知障礙及人格改變?yōu)榕R床主要特征［1－2］。現(xiàn)已公認(rèn)，Aβ為阿爾茨海默病致病的關(guān)鍵因素之一［3－4］。PC12細(xì)胞具有典型神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的特性，是研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的最常見(jiàn)細(xì)胞株，來(lái)源于大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤，可作為良好的神經(jīng)系統(tǒng)體外模型［5－6］。本研究采用“老化”狀態(tài)的 Aβ 作用于 PC12細(xì)胞后β－淀粉樣蛋白基因表達(dá)的變化，觀察地黃飲子含藥腦脊液對(duì)其的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物

大耳白家兔，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。地黃飲子濃縮液(2g/ml)，于4℃保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照藥:鹽酸多奈哌齊。

1.2 試劑、儀器

SYBR?ExScriptTMRT－PCR kit(Perfect Real Time)DRR053S(TAKARA公司);高糖DMEM培養(yǎng)基、D－Hanks緩沖液(Hyclon公司);胎牛血清(杭州四季青公司);鏈霉素、青霉素、Aβ25－35(Sigma公司);胰蛋白酶(Gibco公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(TC 2323D型，中國(guó)廣州南方生化醫(yī)學(xué)部);Real Time PCR System(7300型，美國(guó)ABI公司);PCR System擴(kuò)增儀(2700型，Applied Biosystems公司);紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV－2550型，日本島津)。

1.3 方法

細(xì)胞培養(yǎng)、預(yù)處理:購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)PC12細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基中，其中含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素抗生素。細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱，實(shí)驗(yàn)選材為處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

提取含藥腦脊液:體質(zhì)量2kg大耳白家兔，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，然后連續(xù)3天灌服地黃飲子水煎劑，鹽酸多奈哌齊溶液。末次灌胃后1h立即給予戊巴比妥鈉靜脈麻醉抽取200μl腦脊液，凍存－70℃?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗(yàn)分組、建立PC12細(xì)胞AD模型:實(shí)驗(yàn)分為6組:空白組，模型組，西藥對(duì)照組，地黃飲子低、中、高劑量組;空白組為細(xì)胞培養(yǎng)液，其它各組加入含藥腦脊液，37℃孵育2h后，除空白組之外的各組分別加入經(jīng)老化處理(37℃孵育24h)、終濃度為 10μmol/L的Aβ25－35，建立 PC12細(xì)胞的 AD 模型，繼續(xù)孵育24h，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)的取材階段。

1.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)地黃飲子腦脊液對(duì)PC12細(xì)胞APPmRNA表達(dá)

1)提取總RNA:首先除去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次。采用trizol法提取總RNA。

2)目的基因序列:APP，F(xiàn)orward，5'－TGG GTT GAC AAA CAT CAA GAC AGA A －3';Reverse，5'－GCA CCT TTG TTT GAA CCC ACA TC －3'。

3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42℃ 15min，反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)95℃ 2min。

4)PCR反應(yīng):在ABI7300熒光定量PCR儀采用SYBR Premin ExTap(Perfect Real Time)kit試劑進(jìn)行這一過(guò)程。由熔解曲線判斷PCR反應(yīng)特異性。整個(gè)過(guò)程收集熒光，反應(yīng)結(jié)束后軟件分析檢測(cè)樣本的Ct值，Ct值隨模板濃度的增大而減少。APP mRNA表達(dá)是以差別倍數(shù)2－△△Ct來(lái)表示?！鳌鰿t=△Ct各干預(yù)組－△Ct空白組;△Ct=Ct APP－Ct GAPDH。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)物鑒定 PCR各產(chǎn)物的熔解曲線單一峰，可判斷為單一片段擴(kuò)增，反應(yīng)熔解溫度APP為82.6℃，GAPDH為86.7℃。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳長(zhǎng)度GAPDH和APP均在120～150bp之間，與設(shè)計(jì)的片斷長(zhǎng)度相符合。實(shí)時(shí)定量PCR產(chǎn)物2%凝膠電泳圖見(jiàn)圖1。

圖1 APP電泳圖

圖2 相對(duì)濃度對(duì)數(shù)值

2.2 擴(kuò)增效率分析 隨機(jī)選擇一個(gè)樣本的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以2倍梯度稀釋，以相對(duì)濃度為1、0.5、0.25、0.125作為實(shí)時(shí)PCR的模板進(jìn)行擴(kuò)增。APP和GAPDH的Ct值與之對(duì)應(yīng)的相對(duì)濃度對(duì)數(shù)值作圖(見(jiàn)圖2)，GAPDH和APP對(duì)應(yīng)的直線斜率為－3.338 4和－3.308 5，擴(kuò)增效率按 E=10－1/slope計(jì)算，EAPP 為2.005 4，EGAPDH為1.993 2，結(jié)果表明，擴(kuò)增效率一致，即2－ΔΔCt相對(duì)定量方法適合于本試驗(yàn)，數(shù)據(jù)用(s)表示，用SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.3 地黃飲子含藥腦脊液對(duì)受損 PC12細(xì)胞APP mRNA表達(dá)的影響

分別擴(kuò)增 GAPDH 和 APP，通過(guò)2－△△Ct計(jì)算得到APP相對(duì)mRNA表達(dá)水平。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 APP mRNA相對(duì)定量表達(dá)水平(s)

表1 APP mRNA相對(duì)定量表達(dá)水平(s)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與西對(duì)組比較，○P ＞0.05。

組別 n Ct GAPDH Ct APP △ct －△△ct 2－△△ct空白組5 13.595 ±0.157 18.473 ±0.174 4.878 ±0.093 － －模型組 5 13.583 ±0.117 17.131 ±0.059 3.548 ±0.148 1.330 ±0.156 2.526 ±0.264西對(duì)組 5 13.631 ±0.197 17.432 ±0.173 3.800 ±0.256 1.077 ±0.240 2.134 ±0.361*中低組 5 13.683 ±0.235 17.478 ±0.062 3.795 ±0.196 1.082 ±0.180 2.132 ±0.275＊○中中組 5 13.664 ±0.151 17.489 ±0.157 3.825 ±0.261 1.053 ±0.250 2.010 ±0.353＊○中高組 5 13.621 ±0.089 17.633 ±0.094 4.011 ±0.141 0.867 ±0.010 1.827 ±0.125＊＊○

結(jié)果表明:模型組APP mRNA相對(duì)定量表達(dá)顯著高于空白組(P＜0.01)，說(shuō)明模型組APP mRNA表達(dá)上調(diào);西對(duì)組、地黃飲子腦脊液組與模型組比較APP mRNA相對(duì)定量表達(dá)降低(P＜0.05或P＜0.01)，說(shuō)明地黃飲子含藥腦脊液能夠下調(diào)受損PC12細(xì)胞APP mRNA的表達(dá)，起到保護(hù)細(xì)胞的作用。

3 討論

Aβ的產(chǎn)生、積聚增加是引起神經(jīng)元退化和死亡的主要機(jī)制，它是老年斑的核心成分，也是老年性癡呆發(fā)生的主要原因［7－8］。β－淀粉樣蛋白沉積數(shù)量的多寡與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［9－10］。Aβ蛋白來(lái)源于其前體APP，由于神經(jīng)細(xì)胞膜的損傷和APP異常過(guò)程的結(jié)果而形成［11］，APP基因的點(diǎn)突變、代謝異常及過(guò)度表達(dá)均可引起的Aβ聚集。所以AD防治的戰(zhàn)略重點(diǎn)即為干預(yù)打斷其惡性循環(huán)中的任何一個(gè)環(huán)節(jié)。

地黃飲子用于治療腎氣虛弱，語(yǔ)聲不出，足痿不用的喑痱證。我們已應(yīng)用地黃飲子治療老年性癡呆的病機(jī)做了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究［12－14］。本研究采用 Aβ25－35損傷PC12細(xì)胞的AD模型，通過(guò)FQ－PCR方法檢測(cè)地黃飲子腦脊液對(duì)損傷細(xì)胞APP mRNA的影響。結(jié)果顯示:模型組細(xì)胞APP mRNA相對(duì)定量表達(dá)上調(diào)，與空白組比較有顯著性差異(P＜0.01)。加入含地黃飲子腦脊液后APP mRNA的表達(dá)顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。說(shuō)明地黃飲子在核酸水平降低APP酶的表達(dá)，作用于β－AP的前體蛋白環(huán)節(jié)，從而減少β－AP的沉積，這可能是地黃飲子抗老年性癡呆的機(jī)制之一。

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