張久麗，唐宏偉，孫紅梅，徐世文*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江科技職業(yè)學院，黑龍江 雙城 150100）

微量元素銅為生物機體必需的微量元素之一，對機體的生理功能和生長發(fā)育起著十分重要的作用。銅存在于30多種酶中參與機體的氧化磷酸化、自由基解毒、黑色素合成、兒茶酚胺代謝、結(jié)締組織交聯(lián)、血液凝固及毛發(fā)形成等過程，并能維持組織細胞的穩(wěn)定性[1-2]，所以銅在保證動物健康生長和提高生產(chǎn)力方面起著重要的作用，故廣泛地應(yīng)用于動物飼料中。銅也是重要的化工、金屬原料和醫(yī)藥原料，普遍地應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域。因此，如飼料中添加過量或工業(yè)廢物中銅超標會引起動物銅中毒，并間接通過食物鏈危害人類健康。當反芻動物機體攝入過量的銅，或是飼料中鉬、硫、鈣、鋅等元素含量明顯減少，以及肝細胞受到損害之后，均易引起銅在體內(nèi)特別是肝臟的大量蓄積，從而產(chǎn)生毒性作用，引發(fā)銅中毒[3]。銅中毒在山羊較為嚴重，溶血是其主要特征。目前關(guān)于高銅對山羊紅細胞膜磷脂的損傷和膜流動性的影響還未見報道，因此本試驗以體外培養(yǎng)山羊紅細胞為研究對象，通過向培養(yǎng)液中加入不同濃度的銅，探討高銅對山羊紅細胞膜磷脂組分和膜流動性的影響，為進一步認識高銅致紅細胞溶破機制提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 紅細胞懸液的制備、培養(yǎng)及處理

10～14個月健康山羊5只，頸靜脈無菌采血，肝素抗凝，無菌收集紅細胞，2 500 r·min－1，離心10 min，棄去上清液，加10%的RPMI1640培養(yǎng)液洗滌兩次。將細胞稀釋成1×106個·mL－1，分別加終濃度為 10、20、30、40 和 50 μmol·L－1的 CuSO4，培養(yǎng)48 h后收集細胞。

1.2 紅細胞膜的制備方法

制備原理是在低滲條件下脹破紅細胞，離心后反復(fù)洗滌去除血紅蛋白，即獲紅細胞膜。具體操作如下：取紅細胞懸液20 mL，2 000 r·min－1離心10 min，棄去上清，加10 mL生理鹽水混勻，重復(fù)3次，在留下的紅細胞層中，加入預(yù)冷的10 mmol·L－1Tris－HCl pH 7.4的緩沖液，混勻4℃放置40 min，使其充分溶血，用高速冷凍離心機12 000 r·min－1，離心20 min，棄去含血紅蛋白的上清層，留沉淀，此過程重復(fù)3次，向紅細胞膜中加50 mmol·L－1Tris－HCl pH 7.4的緩沖液懸浮，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 紅細胞膜磷脂組分分析方法

1.3.1 紅細胞膜磷脂的提取

取0.5 mL紅細胞膜懸浮液，加入5.5 mL預(yù)冷的異丙醇，振勻后放冰箱冷藏15 min，取出后置室溫1 h，每隔10 min振勻1次。再加入3.3 mL預(yù)冷的三氯甲烷，振勻后置于冰箱內(nèi)冷藏15 min，取出后置室溫1 h，每隔10 min振勻1次。3 500 r·min－1離心15 min，吸出全部上清液，在50℃水浴中減壓蒸干。

1.3.2 磷脂薄層層析及定性

加200 μL異丙醇于提取磷脂的圓底燒瓶中以溶解提取的磷脂，將溶液吸出注入小試管中。用不活化的硅膠G板展層，上樣量標準品為1 μL，樣品為 3 μL。展層劑為氯仿∶異丙醇∶水=65∶25∶4。放于110℃烘箱中烘干，取出用碘蒸氣熏顯色，得到薄層層析圖。標準品配成1μL∶1μ L的異丙醇標準液。

磷脂組分的定量分析用島津CS－930型光密度掃描儀掃描，波長660 nm，狹縫6 mm×0.2 mm，積分后求得各磷脂組分含量。

1.4 紅細胞膜流動性測定方法

采用李長順等的方法[4]，測定淋巴細胞膜的熒光偏振度（P），并計算成微粘度（η），η值與膜流動性呈反比。

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)用SAS for Windows 6.12軟件進行統(tǒng)計分析，用平均值±標準差（X±S）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅對紅細胞膜磷脂影響的檢測結(jié)果

細胞膜PE百分含量隨染銅劑量的增加逐漸降低，與對照組相比，10 μmol·L－1差異不顯著（P＞0.05），20 μmol·L－1差異顯著（P＜0.05），其他各組差異均極顯著（P＜0.01）。PS百分含量隨染銅劑量的增加逐漸增加，與對照組相比，除10、20 μmol·L－1差異不顯著（P＞0.05）外，其他各組差異均極顯著(P＜0.01)。SM百分含量隨染銅劑量的增加逐漸增加，與對照組相比，10 μ mol·L－1差異不顯著(P＞0.05)，其他各組差異均極顯著（P＜0.01）（見表1和圖1）。

表1 銅對紅細胞膜磷脂影響的結(jié)果Table 1 Results of copper on phospholipid on erythrocytic membrane （%）

2.2 銅對紅細胞膜流動性影響的檢測結(jié)果

2.2.1 銅對紅細胞膜熒光偏振度（P）影響的檢測結(jié)果

加銅組紅細胞膜熒光偏振度隨銅劑量的增加逐漸升高，與對照組間相比差異均顯著(P＜0.05)或極顯著（P＜0.01）（見表 2）。

圖1 各組紅細胞膜磷脂組分薄層層析圖譜Fig.1 Thin-layer chromatogram on phospholipid on erythrocytic membrane

表2 銅對紅細胞膜熒光偏振度影響的檢測結(jié)果Table 2 Results of copper on fluorescence polarizationdegree of erythrocytic membrane

2.2.2 銅對紅細胞膜微粘度影響的檢測結(jié)果

加銅組紅細胞膜微粘度隨銅劑量的增加逐漸增加，10 μmol·L－1、20 μmol·L－1與對照組比較差異不顯著（P＞0.05），其他各組與對照組比較差異極顯著（P＜0.01）（見表 3）。

表3 銅對紅細胞膜η值影響的檢測結(jié)果Table 3 Results of copper on micro-consistency of erythrocytic membrane

3 討論

紅細胞膜磷脂含量（占60%）較其他生物膜高，磷脂含量及其組分的正常是保證膜生理功能的重要因素。細胞膜中不同磷脂在膜脂質(zhì)內(nèi)外層中的分布是不對稱的，PE主要在細胞膜的內(nèi)層，PC主要在細胞膜的外層，這種磷脂排列的有序性是保證膜磷脂正常流動性的必要條件[5]，同時PE中脂肪酸的不飽和程度較高，是維持細胞膜穩(wěn)定性的重要物質(zhì)[6]。而膜流動性是細胞膜的重要生物學特性，是細胞膜功能完整的重要參數(shù)，可以敏感地反映細胞膜狀態(tài)，細胞膜的流動性影響完整的膜蛋白定向、膜滲透性和跨膜轉(zhuǎn)運過程等，而細胞脂質(zhì)過氧化水平的提高能夠影響細胞膜的流動性[7]。

研究表明由低磷發(fā)展至溶血，紅細胞形態(tài)從正常的圓盤狀→棘形→球形→溶破的演變過程，發(fā)生血管內(nèi)溶血時，其紅細胞膜磷脂組分、骨架蛋白及紅細胞形態(tài)發(fā)生顯著改變，是導(dǎo)致溶血的最關(guān)鍵性因素[8]。低硒組奶牛全血中幾種重要的抗氧化酶－谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活力明顯下降；細胞膜蛋白質(zhì)含量明顯低于對照組，其他物理特性也有所改變，表現(xiàn)為在低硒條件下紅細胞膜流動性降低、微黏度增加、滲透脆性增加、離子泵活力下降[9]。

本試驗研究結(jié)果顯示，加銅組山羊紅細胞膜PE的含量低于對照組，PS與SM的含量高于對照組，紅細胞膜熒光偏振度和微粘度增加明顯，流動性明顯降低。表明高銅使紅細胞膜磷脂原有的正常排列和組合發(fā)生改變，PE減少，膜雙層結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性被破壞，因此膜流動性顯著降低。動物體內(nèi)的銅代謝紊亂時常有一價銅的大量產(chǎn)生，生成的一價銅通過Haber－Werss反應(yīng)促進體內(nèi)羥自由基形成，從而使機體發(fā)生氧自由基的損傷[11]。過量銅能引起山羊紅細胞滲透脆性增加，紅細胞溶血度增加，使紅細胞損傷加重[10]。因此分析紅細胞在高銅環(huán)境下，紅細胞抗氧化功能降低，自由基產(chǎn)生增多，紅細胞膜脂質(zhì)雙分子層發(fā)生改變，造成膜結(jié)構(gòu)破壞，進而使膜上鑲嵌的一系列酶空間排列紊亂，活性降低，進而導(dǎo)致膜流動性改變，繼而紅細胞膜穩(wěn)定性、形態(tài)、變形性都有所改變，從而引起溶血現(xiàn)象。以上的研究結(jié)果提示高銅可引起膜磷脂組分含量的改變與膜流動性的改變，這在銅中毒的發(fā)生、發(fā)展中起一定的作用，可能是高銅致羊紅細胞溶破的機制之一。而高銅對紅細胞膜蛋白及抗氧化功能的影響及高銅致紅細胞溶破的其他機制仍需進一步研究。

*唐宏偉為本文的同等貢獻者。

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