賈翠英，歐行奇，王永輝

（1.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

纖維素是世界上最大的可再生有機(jī)資源，我國(guó)的纖維類(lèi)資源極為豐富，僅秸稈和皮殼每年可達(dá)7×108t。目前對(duì)其主要的利用方式是作為低級(jí)燃料，腐化為肥和家畜過(guò)腹還田，因此，有效利用率低。

當(dāng)前，許多國(guó)家已展開(kāi)對(duì)纖維素利用的深入研究，主要集中在兩個(gè)方面：首先酶的基礎(chǔ)研究，即纖維素酶如何使一束纖維從不可溶的聚合物上脫離下來(lái)，催化的化學(xué)機(jī)制以及纖維素酶如何相互作用以實(shí)現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)；其次是酶在實(shí)現(xiàn)生物量轉(zhuǎn)化過(guò)程中的應(yīng)用，即利用纖維素酶轉(zhuǎn)化可再生性的能源物質(zhì)生產(chǎn)化工原料等[1]。然而，由于纖維素酶活力低，一直是阻礙大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的瓶頸，加強(qiáng)纖維素酶產(chǎn)生菌菌種選育、發(fā)酵工藝及降解機(jī)制的基礎(chǔ)研究，利用高效轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素類(lèi)的微生物技術(shù)，將天然纖維素降解為可利用的糖液，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乙醇、乳酸、菌體蛋白、氣體燃料等物質(zhì)，對(duì)解決能源危機(jī)和環(huán)境污染以及生態(tài)保護(hù)是可行的，同時(shí)也是必要的[2-5]。纖維素酶對(duì)纖維素的降解作用主要通過(guò)纖維素外切酶（1,4-β-D-glucan-cellbiohydrolases，EC 3.2.1.91,CBH）、內(nèi)切酶（1,4-β-D-glucan-4-glucanases,3.2.1.4,EG）和纖維二糖酶（β-D-cellobiase,EC 3.2.1.21）三類(lèi)酶的協(xié)同作用[6-8]，不同來(lái)源的菌株其纖維素酶的分子特征和催化性質(zhì)都不盡相同，且酶的最適反應(yīng)條件也有所不同[9-12]。微生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)包括細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、代謝產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)和基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)[13]，通過(guò)對(duì)微生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究和模型的建立，能更好的認(rèn)識(shí)微生物發(fā)酵過(guò)程中菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成機(jī)制，以及影響這些機(jī)制的一些重要因素，最終實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程的有效控制，達(dá)到提高產(chǎn)物發(fā)酵指標(biāo)的目的。

本文以本實(shí)驗(yàn)室從羊瘤胃中篩選分離保存的一株絲狀真菌為研究對(duì)象，通過(guò)靜置液體發(fā)酵試驗(yàn)，對(duì)該絲狀真菌體外轉(zhuǎn)化玉米秸稈產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，并對(duì)動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行了模擬驗(yàn)證,獲得較理想的結(jié)果，從而為進(jìn)一步研究和利用其所產(chǎn)纖維素酶降解玉米秸稈纖維素提供必要的理論依據(jù)，同時(shí)對(duì)于環(huán)境保護(hù)、資源能源再利用等領(lǐng)域具有極大地實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

一株產(chǎn)纖維素酶絲狀真菌，由河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室篩選、分離、保存并提供,該菌株經(jīng)分類(lèi)鑒定為子囊菌屬絲狀真菌（Ascomycotinas sp.）。

1.2 試驗(yàn)原料

玉米秸稈，新鄉(xiāng)市郊外田地里采集，100℃烘干，粉碎，過(guò)40目篩待用。

1.3 培養(yǎng)基

斜面活化培養(yǎng)基：土豆汁100 mL，硫酸銨1%，磷酸二氫鉀0.5%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然。

液體種子培養(yǎng)基：土豆汁100 mL，硫酸銨1%，磷酸二氫鉀0.5%，葡萄糖2%，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：土豆汁100 mL，玉米秸稈12.5%（W/V），pH自然。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化

無(wú)菌操作將所試絲狀真菌接種于斜面培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)72 h，連續(xù)活化兩代。

1.4.2 液體種子培養(yǎng)

無(wú)菌操作將所試絲狀真菌斜面培養(yǎng)物接種于盛有50 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，37℃靜置培養(yǎng)24 h，備用。

1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)

無(wú)菌操作將上述種子液按8%的接種量接種盛有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶?jī)?nèi)，37℃靜置發(fā)酵。

1.4.4 菌體生物量的測(cè)定[14]

菌體生物量的測(cè)定采用生理指標(biāo)法中的菌體含碳量測(cè)定進(jìn)行描述。

1.4.5 產(chǎn)物CMC-Na酶活力的測(cè)定

以CMC-Na酶為代表進(jìn)行產(chǎn)物纖維素酶活力測(cè)定，其方法采用DNS試劑法[15]。首先進(jìn)行葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，然后依照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制步驟進(jìn)行發(fā)酵液中產(chǎn)物纖維素酶活性的測(cè)定。酶活定義為：1 mL粗酶液在1 min分解底物產(chǎn)生1 μg葡萄糖為1個(gè)酶活單位（U）。酶活計(jì)算方法如下：酶活=稀釋酶活測(cè)定值×1 000×稀釋倍數(shù)/反應(yīng)時(shí)間。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作Table 1 Preparation of standard curve of glucose(mL)

1.4.6 底物玉米秸稈纖維素消耗的測(cè)定

利用硫酸蒽酮法測(cè)定纖維素含量[16]，取6支小試管，按照表2分別加入各種試劑，塞上塞子、充分混勻后靜置1 min，然后在620 nm下，測(cè)定不同含量纖維素溶液的吸光度，以測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)，橫坐標(biāo)表示纖維素含量，繪制纖維素含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。發(fā)酵液中纖維素含量測(cè)定同纖維素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制步驟。

表2 纖維素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作Table 2 Preparation of standard curve of cellulose (mL)

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體生物量標(biāo)準(zhǔn)曲線

重鉻酸鉀法測(cè)定生物量所制作的菌體生物量標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。由圖1可知，菌體濃度在0.1～0.8 g·L-1范圍內(nèi)時(shí)，吸光度與菌體濃度成正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)R2=0.99546,可知該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用于菌體生物量的計(jì)算，可為菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型建立和驗(yàn)證時(shí)的數(shù)據(jù)計(jì)算提供依據(jù)。

圖1 菌體生物量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of mycelium biomass

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

DNS法測(cè)定葡萄糖含量所制作的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2，由圖2可以看出，當(dāng)葡萄糖濃度在0.1～0.35 g·L-1范圍內(nèi)時(shí)，吸光度和葡萄糖濃度之間有著良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.99554，可知該葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線能較好地進(jìn)行產(chǎn)物CMC-Na酶活力的測(cè)定和計(jì)算，為產(chǎn)物酶形成動(dòng)力學(xué)模型建立和驗(yàn)證時(shí)的數(shù)據(jù)計(jì)算提供依據(jù)。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of glucose

2.3 纖維素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

硫酸蒽酮法測(cè)定基質(zhì)纖維素含量所繪制的纖維素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3。由圖3可知，纖維素濃度在40～180 mg·L-1范圍內(nèi)，吸光度和纖維素濃度具有良好的線性相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)R2=0.99228?？芍摾w維素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于玉米秸稈中纖維素含量變化的計(jì)算，從而用于基質(zhì)纖維素消耗動(dòng)力學(xué)模型建立和驗(yàn)證時(shí)的數(shù)據(jù)計(jì)算提供依據(jù)。

圖3 纖維素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of cellulose content

2.4 批式發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

批式發(fā)酵結(jié)果如圖4(a，b)。該絲狀真菌的各個(gè)生長(zhǎng)階段比較分明。菌體生長(zhǎng)的延滯期較長(zhǎng)，18 h后逐步進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，當(dāng)發(fā)酵至72 h左右時(shí)，菌體生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期，此后細(xì)胞生物量維持恒定，96 h獲得最大菌體干重為9.046 g·L-1。纖維素基質(zhì)含量的變化為逐漸降低趨勢(shì)。而由產(chǎn)物酶的形成曲線可知，產(chǎn)物酶的形成與細(xì)胞的生長(zhǎng)是同步的，其二者的關(guān)系表現(xiàn)為偶聯(lián)型，即菌體快速生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)物酶也大量積累生成，菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定期時(shí)產(chǎn)物酶不在大量積累而基本維持恒定。此外，由圖4還可知，底物纖維素消耗曲線、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)物酶的形成曲線三者有一定的相關(guān)性，即細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，對(duì)底物的利用速度較快。

圖4 批式發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Results of batch fermentation

2.5 細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型

在子囊菌屬絲狀真菌(Ascomycotinas sp.)轉(zhuǎn)化玉米秸稈纖維素的分批發(fā)酵過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，高濃度底物對(duì)該絲狀真菌產(chǎn)生抑制，因此，不宜采用經(jīng)典的Monod模型來(lái)描述其細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特征。Logistic方程能很好地反映分批發(fā)酵過(guò)程菌體生長(zhǎng)與底物濃度之間的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，具有廣泛的適用性。Logistic方程為：

式中，Cx為細(xì)胞濃度（g·L-1DW），Cxm為最大細(xì)胞濃度（g·L-1DW），μm為最大比生長(zhǎng)速率（h-1）。以t=0時(shí)，Cx=Cx0為初始條件，上式積分后，可得：

將（2）式整理后得：

2.6 產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型

Gaden根據(jù)產(chǎn)物生成速率與細(xì)胞生長(zhǎng)速率之間的關(guān)系，將其分為三種類(lèi)型：生長(zhǎng)偶聯(lián)模型；混合模型又稱(chēng)為L(zhǎng)uedeking-Piret模型和非生長(zhǎng)偶聯(lián)模型。從該絲狀真菌分批發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，產(chǎn)物CMC-Na酶的生成是伴隨在菌體生長(zhǎng)過(guò)程中的，可采用生長(zhǎng)偶聯(lián)模型描述產(chǎn)物酶的生成動(dòng)力學(xué)特征。

生長(zhǎng)偶聯(lián)模型的數(shù)學(xué)表達(dá)式為：

穩(wěn)態(tài)時(shí)，dCx/dt=0，Cx=Cxm

將式（4）積分后得：

式（5）可簡(jiǎn)寫(xiě)為如下形式：

其中，

式(7)中 μm，Cxm，Cx0均已知，以 [CP] 對(duì) A（t）作圖，直線斜率即為α值。

2.7 底物消耗動(dòng)力學(xué)模型

底物消耗主要用于三個(gè)方面：細(xì)胞生長(zhǎng)消耗；細(xì)胞維持基本生命活動(dòng)消耗；合成代謝產(chǎn)物的消耗。因此可用如下動(dòng)力學(xué)方程表示：

式中，CS為基質(zhì)濃度（mg·L-1），CX為細(xì)胞濃度（g·L-1，干重），CP為酶活力單位（U·L-1），m 為細(xì)胞的維持系數(shù)（s-1），Yx/s為菌體相對(duì)于基質(zhì)的得率系數(shù)（g細(xì)胞·mg-1基質(zhì)），其定義為生成細(xì)胞的干重與用于細(xì)胞生長(zhǎng)而消耗基質(zhì)的質(zhì)量之比。Yp/s為產(chǎn)物相對(duì)于基質(zhì)的得率系數(shù)（U·mg-1基質(zhì)）。

將式（4）代入式（8）后得：

式(9)可簡(jiǎn)化為：

由于維持細(xì)胞生長(zhǎng)的消耗很小，所以可以忽略不計(jì)，即=0

式(10)可簡(jiǎn)化為：

將式(11)積分后得：

式(12)簡(jiǎn)化為：

式（13）中 γ 可由式（11）得到，μm，Cxm，Cx0均已知，以[Cs0-Cs]對(duì)C（t）作圖，直線斜率即為γ值。

2.8 模型求解

將上述各個(gè)動(dòng)力學(xué)模型根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用計(jì)算機(jī)模擬求解，得模型中的各個(gè)參數(shù)及試驗(yàn)初始條件如表3所示：

表3 動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)及初始條件Table 3 Parameters value in the kinetic models and initial conditions of batch fermentation for filamentous fungi

2.9 模型的驗(yàn)證

在已知試驗(yàn)條件下，進(jìn)行絲狀真菌分批轉(zhuǎn)化玉米秸稈纖維素的重復(fù)試驗(yàn)，分別測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)，產(chǎn)物酶合成及底物纖維素消耗并繪制曲線，然后對(duì)分批發(fā)酵試驗(yàn)的試驗(yàn)值與動(dòng)力學(xué)模型曲線的模型值進(jìn)行擬合，得圖5～7。

圖5 細(xì)胞生長(zhǎng)模型值與試驗(yàn)值比較Fig.5 Comparison of cell growth model value and test value

圖6 產(chǎn)物酶動(dòng)力學(xué)模型值與試驗(yàn)值比較Fig.6 Comparison of enzyme activity model value and test value

圖7 纖維素消耗動(dòng)力學(xué)模型值與試驗(yàn)值比較Fig.7 Comparison of cellulose consumption model value and test value

圖7分別顯示了細(xì)胞生長(zhǎng)的模型值，產(chǎn)物酶合成的模型值和底物消耗的模型值與試驗(yàn)實(shí)測(cè)值擬合程度，其相對(duì)誤差分別為0.1998、5.9035和0.00072，相關(guān)系數(shù)分別為 0.98827、0.98283和0.99599，結(jié)果顯示了所建底物消耗動(dòng)力學(xué)模型能夠很好地描述絲狀真菌兼性厭氧液體發(fā)酵過(guò)程中對(duì)基質(zhì)的消耗規(guī)律；而所建立的細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型和產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)模型只是基本能較好的反映微生物的實(shí)際生長(zhǎng)和產(chǎn)酶過(guò)程，其模型值與實(shí)測(cè)值的相對(duì)誤差均大于15%。分析可知造成較高相對(duì)誤差的區(qū)域主要分布在菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期后期，此時(shí)由于菌體生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)開(kāi)始出現(xiàn)匱乏，造成部分菌體生長(zhǎng)速率下降甚至開(kāi)始出現(xiàn)菌體死亡，因此，所測(cè)試驗(yàn)值與模型值出現(xiàn)較大偏差。此外，由于菌體產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)特征顯示其產(chǎn)酶與菌體生長(zhǎng)表現(xiàn)為偶聯(lián)型，因此造成產(chǎn)物酶合成的模型值與實(shí)測(cè)值也表現(xiàn)為較高的相對(duì)誤差。再者，造成產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)模型值與試驗(yàn)實(shí)測(cè)值相對(duì)誤差較大的另一方面的原因可能是微生物所產(chǎn)纖維素酶系為一復(fù)合酶系，其他酶如纖維素外切酶，β-葡萄糖苷酶等的存在可能對(duì)CMC-Na酶活大小有一定影響。

3 討論與結(jié)論

微生物發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是生物反應(yīng)工程學(xué)的理論基礎(chǔ)，通過(guò)數(shù)學(xué)模型定量表達(dá)發(fā)酵過(guò)程中各種與微生物生長(zhǎng)、基質(zhì)消耗和產(chǎn)物形成有關(guān)的因素，可進(jìn)一步了解微生物的生理特征，菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成的合適條件，以及各發(fā)酵參數(shù)之間的關(guān)系，從而為發(fā)酵過(guò)程的工藝控制，反應(yīng)器放大以及利用計(jì)算機(jī)對(duì)發(fā)酵過(guò)程實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制創(chuàng)造條件。

不同的微生物具有不同的生長(zhǎng)代謝特性和代謝規(guī)律，通過(guò)建立微生物的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型可以更好地發(fā)揮微生物自身特點(diǎn)以實(shí)現(xiàn)更有效的發(fā)酵和控制，從而最大限度地獲得理想產(chǎn)物。Logistic方程和Luedeking-Piret方程對(duì)于描述微生物生長(zhǎng)、基質(zhì)消耗和產(chǎn)物形成具有廣泛適應(yīng)性，然而，微生物發(fā)酵過(guò)程的復(fù)雜性以及影響因素的多變性，使得所建發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型并不能完全反映實(shí)際的微生物發(fā)酵過(guò)程。為此，在以后的研究過(guò)程中需要對(duì)實(shí)際發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行多次優(yōu)化以及對(duì)所建模型進(jìn)行修正和補(bǔ)充，使模型值與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合較好。

本文通過(guò)Logistic方程和Luedeking-Piret方程，獲到了產(chǎn)纖維素酶絲狀真菌的兼性厭氧液體發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型包括細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型、底物消耗動(dòng)力學(xué)模型及產(chǎn)物酶合成動(dòng)力學(xué)模型及模型的參數(shù)，并對(duì)試驗(yàn)實(shí)測(cè)值與模型值進(jìn)行了驗(yàn)證比較。結(jié)果表明，模型計(jì)算值與試驗(yàn)值擬和良好，相關(guān)系數(shù)分別為：0.98827、0.98283和0.99599，所建模型能較好地描述該絲狀真菌生物降解玉米秸稈產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)特征，該研究不同于以往報(bào)道中的生產(chǎn)菌株大多為好氧微生物[17-20]，該菌為兼性厭氧微生物，在發(fā)酵產(chǎn)酶上具有顯著優(yōu)勢(shì)，研究其兼性厭氧發(fā)酵動(dòng)力學(xué)對(duì)于進(jìn)一步優(yōu)化其產(chǎn)酶條件和提高產(chǎn)酶能力具有一定的參考價(jià)值和理論意義。

[1] Ragauskas A J,Williams C K,Davison B H,et al.The path forward for biofuels and biomaterials[J].Science,2006,311(5760):484-489.

[2] 楊葉東,韓袆君,張金龍.纖維素酶的研究、生產(chǎn)及其在紡織上的應(yīng)用[J].激光生物學(xué)報(bào),2000,9(2):151-153.

[3] Zhang Y H P,Lynd L R.Toward an aggregated understanding of enzymatic hydrolysis of cellulose:Non-complexed cellulase systems[J].Biotechnol Bioeng,2004,88:797-824.

[4] Oksanen T,Pere J,Paavilainen L,et al.Treatment of recycled Kraft pulps with Trichoderma reesei hemicellulases and cellulases[J].J Biotechnol,2000,78(1):39-48.

[5] Mach R L,Zeilinger S.Regulation of gene expression in industrial fungi:Trichoderma[J].Appl.Microbiol.Biotechnol,2003,60:515-522.

[6] Khalid M,Yang W J,Kishwar N,et al.Study of cellulolytic soil fungi and two nova species and new medium[J].J Zhejiang Univ Sci B,2006,7:459-466.

[7] 齊云,袁月祥,陳飛,等.一組纖維素分解菌的分離、篩選及其產(chǎn)酶條件的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2003,15(6):235-237.

[8] 高榕,鄧迎達(dá).高生產(chǎn)效率纖維素酶菌株初篩方法的研究[J].纖維素科學(xué)與技術(shù),2004,12(3):20-24.

[9] Lynd L R,Weimer P J,Van Z W H,et al.Microbial cellulose utilization:Fundamentals and biotechnology[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,2002,66(3):506-577.

[10] Seo J H,Li H X,Kim M J,et al.Determination of agitation and aeration conditions for scale-up of cellulolytic enzymes production by Trichoderma inhamatum[J].KSJ1 Korean J Chem Eng,2007,24(5):800-805.

[11] Li H X,Kim M J，Kim S J.Cost-cutting of nitrogen source for economical production of cellulolytic enzymes by Trichoderma inhamatum[J].KSJ1 Korean J Chem.Eng.,2009,26(4):1070-1074.

[12] Chandra M S,Buddolla V B,Rajasekhar R.Cellulolytic enzymes on lignocellulosic substrates in solid state fermentation by Aspergillus niger[J].Indian J.Microbiol,2007,47:323-328.

[13] 武崢,張迎君,張超,等.綠色木霉T206產(chǎn)纖維素酶特性與酶促動(dòng)力學(xué)研究[J].南方農(nóng)業(yè),2008,2（11）:11-13.

[14] 中國(guó)價(jià)值百科[2011-3-4].[EB/OL].http://www.chinavalue.net/wiki/showcontent.aspx?titleid=186939

[15] 張洪斌,陳賢東,胡雪芹,等.一株里氏木霉產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵研條件的研究[J].食品科學(xué),2006,27(12):185-187.

[16] Leagene.北京雷根生物技術(shù)有限公司.[EB/OL].[2010-04-10]http://www.leagene.com/jszx/jszl/2010-04-10/1825.html

[17] 馬懷良,郭文學(xué),柴軍紅.常溫高效纖維素分解菌的篩選[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,41(1):52-55.

[18] 劉保平,王宏燕,房紅巖,等.降解秸稈的細(xì)菌和放線菌的分離與篩選[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,41(2):49-54.

[19] 劉震東，李文哲，劉爽，等.高效木質(zhì)纖維素分解菌復(fù)合系的發(fā)酵特性[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,40(8):105-109.

[20] 張丹,許景鋼,路偉明,等.低溫降解纖維素的細(xì)菌的篩選及鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,39(1):55-57.