旭，孫立勝，史冬泉，

(南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院，南京 210008)

生長分化因子5(GDF5)，又稱軟骨來源形成蛋白1，屬骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)家族，也是轉(zhuǎn)化生長因子 β(TGF-β)超家族成員之一［1］，是骨骼系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)因子，在骨骼發(fā)育過程中對軟骨內(nèi)成骨，骨與關節(jié)的形成起著重要作用［2］。2010年1～12月，我們采用PCR技術(shù)成功構(gòu)建含GDF5基因表達載體pGL3-GDF5?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 載體pGL3-Basic，大腸桿菌DH10b感受態(tài)細胞(南京大學模式動物研究所高翔實驗室饋贈)，高保真酶Primer Star，dNTP，T4連接酶，限制性內(nèi)切酶BglⅡ、HindⅢ(大連寶生物工程有限公司)，基因組DNA抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(Promega公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計及合成 根據(jù)GDF5的GenBank中NM000557檢索序列，設計一對特異性引物(上海英駿生物技術(shù)有限公司合成)，5'端分別加入BglⅡ、HindⅢ酶切位點。上游引物序列:5'-GAAGATCTCT GGAAAGGATTCAAAACTAGGG-3'，下游引物序列:5'-CCCAAGCTTGGGGACAGATCCTGCTTT-3'。

1.2.2 基因組DNA提取 用基因組DNA抽提試劑盒提取健康人外周血基因組DNA，作為PCR擴增模板。

1.2.3 PCR 擴增 PCR 反應體系50 μl，反應參數(shù):94℃預變性3 min后，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，于72℃延伸5 min。將PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，按DNA凝膠回收試劑盒說明書純化回收。

1.2.4 重組質(zhì)粒pGL3-GDF5的構(gòu)建 分別用限制性內(nèi)切酶 BglⅡ和 HindⅢ對回收的 PCR產(chǎn)物和pGL3-Basic載體質(zhì)粒進行雙酶切，按照DNA凝膠回收試劑盒說明，切膠純化酶切后的pGL3-Basic載體質(zhì)粒大片段和GDF5基因啟動子片段，在T4連接酶的作用下，將兩者16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10b感受態(tài)細胞，菌液均勻涂布于含有氨芐青霉素(Amp)的LB平板，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，隨機挑取2個陽性克隆，置于LB/Amp液態(tài)培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)12 h，根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒說明書，提取質(zhì)粒DNA(pGL3-GDF5)，BglⅡ和HindⅢ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，同時菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。

2 結(jié)果

2.1 GDF5基因擴增結(jié)果 通過上、下游引物進行PCR擴增后，得到1條長度為854 bp的PCR產(chǎn)物，見圖1。

圖1 GDF5基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒pGL3-GDF5連接后鑒定結(jié)果 挑選陽性克隆菌落，PCR鑒定結(jié)果所產(chǎn)生的結(jié)果見圖2。pGL3-Basic質(zhì)粒大片段為4 801 bp，如插入854 bp外源基因GDF5啟動子，其擴增長度應為兩者之和(約5 655 bp)，證明兩者連接成功。

圖2 質(zhì)粒連接后鑒定結(jié)果

2.3 重組質(zhì)粒雙酶切及測序鑒定 重組質(zhì)粒載體pGL3-GDF5經(jīng)BglⅡ和HindⅢ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳，顯示出4 801 bp的大片段和854 bp的小片段，與理論結(jié)果相符，證明質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖3。雙向測序結(jié)果與GenBank中GDF5序列完全匹配。

3 討論

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切電泳結(jié)果

GDF5是一種分泌性多功能蛋白［3］。研究發(fā)現(xiàn)GDF5是一種在胚胎肢體發(fā)育尤其是軟骨與關節(jié)形成中扮演關鍵角色的調(diào)節(jié)因子，在機體軟骨形成及發(fā)育中的作用受到人們的關注。首先GDF5能夠促進間充質(zhì)細胞在關節(jié)將要形成的部位聚集，這是軟骨形成的最初步驟;后期主要是促進間充質(zhì)細胞向成軟骨細胞分化，刺激軟骨細胞增生、肥大［4～7］。

關節(jié)軟骨損傷的修復是臨床治療中的難點［8］。由于關節(jié)軟骨的不可再生性，一旦發(fā)生損傷，嚴重影響肢體關節(jié)功能。目前，GDF5在一些試驗中對于關節(jié)軟骨損傷的修復作用已經(jīng)得到了證實［9，10］。體外試驗也表明GDF5能夠增強軟骨細胞聚集、誘導軟骨分化并促進其成熟［11］。可見探討軟骨損傷、修復過程的分子機制將對臨床骨性關節(jié)炎的治療有極大影響。

pGL3-Basic載體不含啟動子及增強子，通過將啟動子序列克隆到熒光素酶基因的上游，即可測定其是否具有啟動熒光素酶基因表達的活性。與其他檢測系統(tǒng)相比，熒光素酶檢測系統(tǒng)具有非放射性、半衰期較短、操作簡單、結(jié)果直觀、靈敏度高等優(yōu)點。因而適合對基因瞬時表達的研究，是研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的一種理想的報告基因載體。研究表明質(zhì)粒pGL3-Basic的多克隆位點中含的BglⅡ和HindⅢ內(nèi)切酶位點，在設計擴增目的片段的上下游引物中加上同樣的雙酶切位點，這樣在構(gòu)建重組表達質(zhì)粒的連接中就可以使目的片段按正確的方向插入載體中，即定向克隆。

本實驗采用RT-PCR方法合成GDF-5啟動子基因，并插入到質(zhì)粒pGL3-Basic上，經(jīng)過酶切鑒定和測序證實表達載體pGL3-GDF5構(gòu)建成功，為進一步研究GDF5在軟骨發(fā)育及分化中的作用機制提供直接的實驗依據(jù)，為體外誘導軟骨形成提供實驗基礎，為將來用于臨床治療骨關節(jié)軟骨損傷開拓了思路。

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