(1河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部，河北保定 071000;2河北大學(xué)圖書(shū)館;3河北大學(xué)預(yù)防與衛(wèi)生管理系)

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的腫瘤，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)信號(hào)傳導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)大多數(shù)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。EGF是EGFR的配體，EGF對(duì)膠質(zhì)瘤的影響機(jī)制并不十分清楚。2010年6～8月，我們觀察不同濃度的EGF對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增值能力的影響，探討EGF在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251為本校實(shí)驗(yàn)室凍存。EGF(Sigma公司)溶解于二甲基亞砜(DMSO)中配制成1 000 ng/ml母液，分裝后－86℃保存。實(shí)驗(yàn)前用新鮮DMEM(Gibco公司)培養(yǎng)液按比例稀釋至終濃度，冰上避光操作。MTT(Sigma公司)，鼠抗人Ki-67單克隆抗體及免疫組化其他試劑(福州邁新生物有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 U251用含10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，培養(yǎng)液加1%雙抗(青霉素、鏈霉素)，0.25%胰酶消化傳代。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，再用含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為 1 ×104，接種于96 孔板上，每孔180 μl，設(shè)空白對(duì)照孔。分別加入10、50、100、200 ng/ml的EGF作用24 h(實(shí)驗(yàn)組)，以不加EGF的細(xì)胞為對(duì)照組。各設(shè)5個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)及方法 ①U251形態(tài):采用倒置顯微鏡觀察。②細(xì)胞增殖力:采用MTT法檢測(cè)U251細(xì)胞增殖力。酶標(biāo)儀設(shè)570 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)各孔的吸光度值(A值)。③U251中 Ki-67:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞滴加在多聚賴(lài)氨酸處理的無(wú)菌載玻片上，細(xì)胞爬滿載玻片后經(jīng)冷丙酮固定15 min，采用免疫組織化SP法檢測(cè)細(xì)胞中Ki-67。以細(xì)胞核呈棕黃或棕褐色為陽(yáng)性細(xì)胞，在高倍鏡(400×)下隨機(jī)選取10個(gè)視野，以陽(yáng)性染色的細(xì)胞數(shù)與所測(cè)細(xì)胞數(shù)的比為增殖指數(shù)(PI)［1］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，采用方差分析，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)。α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 U251的形態(tài)學(xué)改變 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組貼壁瘤細(xì)胞數(shù)量明顯增加，排列密集，不同劑量的EGF能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。

2.2 兩組細(xì)胞增殖力比較 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組中加入10、50、100、200 ng/ml EGF的細(xì)胞A值隨著EGF濃度的提高而增加，100 ng/ml時(shí)A值最高，呈劑量—效應(yīng)關(guān)系(P＜0.05);與加入100 ng/ml EGF的細(xì)胞A值比較，加入200 ng/ml EGF的細(xì)胞A值下降(P＜0.05)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度EGF對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響

2.3 兩組U251中Ki-67 PI比較 對(duì)照組Ki-67 PI為16.2 ±1.9;實(shí)驗(yàn)組中，加入10、50、100、200 ng/ml EGF 的細(xì)胞中 Ki-67 PI分別為 23.1 ±1.7、33.9 ±2.8、46.0 ±3.2、20.4 ±1.5。100 ng/ml的 EGF 作用下U251中Ki-67 PI為最高(P＜0.05)。

3 討論

EGF介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)腫瘤細(xì)胞活性的影響是目前的研究熱點(diǎn)之一。EGF能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，并在細(xì)胞分化、新生血管形成方面起一定作用。EGF與EGFR結(jié)合后，引起質(zhì)膜或胞內(nèi)酪氨酸殘基特異蛋白激酶從失活轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问?，磷酸化EGFR(p-EGFR)是EGFR活化形式?？杉せ钕掠蔚亩喾N細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路而促進(jìn)細(xì)胞增殖，調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)活性。

本研究發(fā)現(xiàn)，在加入一定濃度的外源性EGF(10～100 ng/ml)后，U251 A值隨EGF濃度的增加而增加，表明一定劑量的EGF可以促進(jìn)U251細(xì)胞增殖。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組貼壁瘤細(xì)胞數(shù)量明顯增加，排列密集，從形態(tài)學(xué)上支持了一定劑量EGF的促細(xì)胞增殖效應(yīng)，提示小劑量EGF有促進(jìn)U251細(xì)胞增殖的作用。分析原因這可能與EGF介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路被活化從而促進(jìn)了U251生長(zhǎng)有關(guān)。

細(xì)胞增殖率與腫瘤生長(zhǎng)、侵襲能力密切相關(guān)，因此檢測(cè)腫瘤增殖活性對(duì)腫瘤生物學(xué)行為判斷具有重要意義［2］。Ki-67是一種與細(xì)胞有絲分裂密切相關(guān)的抗原，與細(xì)胞增殖有著密切的關(guān)系，其基因定位在10號(hào)染色體上。作為細(xì)胞與細(xì)胞周期密切相關(guān)的細(xì)胞核蛋白，Ki-67是目前認(rèn)為最重要的細(xì)胞增殖標(biāo)記物［3，4］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組隨EGF劑量的增加(10～100 ng/ml)，U251中Ki-67 PI增加，Ki-67表達(dá)上調(diào)，呈劑量依賴(lài)性，說(shuō)明隨著EGF的劑量增加U251細(xì)胞增殖潛能也在不斷地增加。

我們還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)EGF增加至200 ng/ml時(shí)，實(shí)驗(yàn)組A值下降，PI也下降，提示高濃度EGF對(duì)U251促增殖作用減弱，說(shuō)明EGF能夠雙向調(diào)節(jié)U251的生物學(xué)活性。這與EGF對(duì)GL15細(xì)胞增殖的影響一致［5］。分析原因可能與EGF的受體消耗以及細(xì)胞自身的負(fù)反饋有關(guān)，提示我們高濃度EGF對(duì)U251的生長(zhǎng)抑制作用可為臨床治療膠質(zhì)瘤提供另一條思路。

總之，一定濃度范圍內(nèi)的EGF可促進(jìn)U251細(xì)胞增殖，EGF可以雙向調(diào)節(jié)U251的生物學(xué)活性，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用。

［1］崔勇，王洪，方川，等 .人腦膠質(zhì)瘤組織中EGFR、MMP-9、Ki67的表達(dá)及意義［J］.山東醫(yī)藥，2010，50(38):77-78.

［2］Scholzen T，Gerdes J.The Ki-67 protein:from the known and the unknown［J］.J Cell Physiol，2000，182(3):311-322.

［3］DuchrowM，Gerdes J，Schluter C.The proliferation associated Ki67 protein:definition inmolecular terms［J］.Cell Prolif，1994，27(5):235-242.

［4］Nakano T，Oka K.Differential values of Ki-67 index andmitotic index of proliferating cell population:an assessment of cell cycleand prognosis in radiation therapy for cervical cancer［J］.Cancer，1993，72(8):2401-2408.

［5］席桂發(fā)，王寶峰，王和平，等.EGF和AG1478對(duì)GL15細(xì)胞增殖、侵襲和GFAP表達(dá)的影響［J］.中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2007，6(4):302-304.