林 晶

(北京市朝陽區(qū)婦兒醫(yī)院，北京 100021)

阿莫西林克拉維酸鉀是一種可供口服、肌肉注射、靜脈注射的β－內酰胺類和β－內酰胺酶抑制劑抗生素，主要用于敏感菌引起的呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、皮膚及軟組織感染，現廣泛應用并作為抗菌感染的一線治療藥物。筆者建立了快速、準確、同時測定阿莫西林和克拉維酸血藥濃度的高效液相色譜(HPLC)法，現報道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀系統(tǒng)，包括Waters 510型泵(美國Waters公司)，Waters 490E型紫外檢測器，WDL－95型大連色譜工作站，Sartorius電子天平(1/10萬)。阿莫西林對照品(含量為86.2%，批號為 130409－200208)，克拉維酸對照品(含量為 95.0%，批號為130429－200203)，內標物為對乙酰氨基酚(批號為 100018－200408，含量為99.5%)，均由中國藥品生物制品檢定所提供;阿莫西林克拉維酸鉀(4∶1)分散片(商品名博美欣片，每片156.25 mg，批號為20040406，東藥集團沈陽施德藥業(yè)有限公司);甲醇和乙腈(HPLC純，美國Tedia公司);磷酸二氫鉀、磷酸(AR);水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Phenomenex luna C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm); 柱溫:室溫;流動相:磷酸鹽緩沖溶液(pH=3.0)－乙腈(95∶5，V/V);流速:1.2 mL/min;靈敏度:0.005 AUFs;紫外檢測波長:230 nm;進樣量 20 μL。

2.2 標準貯備液的配置

分別精密稱取阿莫西林和克拉維酸對照品5.0 mg，用三重蒸餾水定容至10 mL容量瓶中，配制成0.5 g/L的標準溶液，分裝于一次性帶蓋塑料杯中并做好標記，置－40℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＞芊Q取內標5.0 mg，用三重蒸餾水定容至10 mL容量瓶中配制成0.5 g/L的溶液，再精密量取1 mL，用三重蒸餾水定容至10 mL量瓶中，配制成50μg/mL的內標溶液，置冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血漿樣品處理

取血漿0.2 mL，加入內標(對乙酰氨基酚質量濃度為50μg/mL)10 μL，再加入冷甲醇 0.4 mL，渦旋混勻 1 min，12000 r/min 轉速離心5 min，取上清液20 μL進樣。

2.4 方法學考察

專屬性考察:取空白血漿、加藥血漿、受試者血漿，依法進樣，色譜圖見圖1。可見，克拉維酸、阿莫西林、內標與血漿內源峰分離良好，保留時間分別為 5，9，15 min。

圖1 高效液相色譜圖

標準曲線制備:取7支具塞離心管，第1管加入空白血漿0.4mL，其余管分別加入空白血漿0.2 mL，然后在第1管中加入10 μL阿莫西林和6 μL克拉維酸標準貯備液，混勻后用等倍稀釋法再配成含阿莫西林 13.20，6.60，3.30，1.65，0.83，0.41，0.21μg/mL 和克拉維酸 8.60，4.30，2.15，1.07，0.54，0.27，0.13μg/mL 的血漿樣品，按照2.3項下方法操作，測定色譜峰面積，以樣品峰面積與內標峰面積的比值為 Y軸、質量濃度為 X軸進行回歸。得標準曲線回歸方程，阿莫西林 Y=0.1485 C+0.006714， r=0.9998(n=7)，線性范圍為 0.21 ～13.20μg/mL;克拉維酸 Y=0.0778+0.0161，r=0.9994(n=7)，線性范圍為 0.13 ～8.60μg/mL。最低定量限阿莫西林為 0.2μg/mL，克拉維酸為 0.1μg/mL。

回收率試驗:以3種高、中、低質量濃度的阿莫西林克拉維酸血漿標準品進行回收試驗，按照2.3項下操作，測定結果代入血漿標準曲線計算其質量濃度，以實測質量濃度與理論質量濃度之比求算回收率。結果見表1。

表1 阿莫西林克拉維酸回收率試驗結果(n=5，D)

表1 阿莫西林克拉維酸回收率試驗結果(n=5，D)

理論質量濃度(μg/mL) 實測質量濃度(μg/mL) 回收率(%)阿莫西林13.201.650.41克拉維酸8.601.070.27阿莫西林13.59 ± 0.621.70 ± 0.170.45 ± 0.05克拉維酸8.48 ±0.461.04 ±0.090.30 ±0.04阿莫西林102.94103.27110.73克拉維酸98.6597.57111.85

精密度試驗:以3種高、中、低質量濃度的阿莫西林克拉維酸血漿樣品，按照擬訂的方法操作，測定峰面積比。3種質量濃度于1 d內分別連續(xù)測定5次，計算測得值的變異(RSD);每天配制高、中、低3種質量濃度樣品各1份，連續(xù)5 d，每天測定1次，計算測得值的變異(RSD)。結果見表2。

表2 精密度試驗結果(n=5，)

表2 精密度試驗結果(n=5，)

組分 測得質量濃度(μg/mL) 精密度的 RSD(%)加入質量濃度(μg/mL)阿莫西林克拉維酸13.201.650.418.601.070.27日內13.40 ± 0.351.62 ± 0.050.48 ± 0.038.81 ± 0.291.09 ± 0.050.28 ± 0.02日間13.59 ± 0.621.72 ± 0.130.45 ± 0.058.47 ± 0.461.04 ± 0.090.30 ± 0.04日內2.582.896.173.314.378.11日間4.597.6512.075.478.6713.73

穩(wěn)定性試驗:由于克拉維酸血漿樣品常溫下不穩(wěn)定，因此本試驗除考察了其精密度外，還考察了其長期－40℃冰箱保存的穩(wěn)定性。結果克拉維酸血漿樣品在此條件下保存15 d穩(wěn)定，待測血漿樣品處理后測定，RSD均小于15%。

2.5 樣品測定

1例健康男性志愿者，禁食12 h后，于早晨8:00空腹用200 mL室溫的水送服博美欣片，劑量為625 mg。服藥前1 h至服藥后4 h內控制飲水，服藥后4 h進標準餐。受試者在服藥后避免劇烈活動。取血操作在臨床監(jiān)護室中進行。受試者肘靜脈處埋入留置針，分別于服藥前及服藥后 0.25，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00 h 抽取受試者靜脈血 3 mL，肝素抗凝，立即離心，分離出血漿后，置－40℃冰箱保存待測。按照擬訂方法操作，測定峰面積比，測定結果代入血漿標準曲線計算其質量濃度。結果見表3。

表3 阿莫西林克拉維酸樣品測定結果(μg/mL)

3 討論

關于阿莫西林和克拉維酸的含量測定，文獻報道的有微生物法[1]和高效液相色譜法[2－4];檢測的標本微生物法[2]采用血漿，高效液相色譜法除文獻[2]采用血清，其余[3－4]均采用血漿，但采用高效液相色譜法的文獻均使用衍生化提取樣品。筆者所建立的高效液相色譜法，采用血漿直接提取操作。

本試驗在文獻[5]報道的方法基礎上對流動相的比例等條件進行了改變，由于其報道中口服量較大(750 mg)，且克拉維酸含量較大(阿莫西林∶克拉維酸為2∶1)，故本試驗使用了內標參照以減小誤差;另外，由于克拉維酸穩(wěn)定性較差，文獻[2－4]采用柱前衍生化法，文獻[6]采用4℃離心法，方法較煩瑣，而本法采用冷甲醇沉淀，離心時間縮短，離心后用保溫瓶冰浴保存，并當天內完成。本試驗操作簡單、結果準確，并可同時測定阿莫西林和克拉維酸的血藥濃度。

根據初步試驗結果可見，與國外報道阿莫西林克拉維酸(4∶1)用藥1 h后達平均血藥濃度峰值的時間相當。本法快速準確，比較適用于臨床檢測，可為阿莫西林和克拉維酸血藥濃度生物等效性研究提供簡便、易行、準確的方法。

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[3]周建設，申屠建中，盧曉陽，等.高效液相色譜衍生化法同時測人血清中阿莫西林和克拉維酸濃度[J].中國藥學雜志，2004，17(7):538－539.

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