邵志凌，何學(xué)心，向謹(jǐn)逸

(1.武漢鐵路局社會(huì)保險(xiǎn)管理處，武漢 430071;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，武漢 430030;3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)系，武漢 430030)

心肌纖維化指心肌間質(zhì)膠原纖維過(guò)量積聚或成分發(fā)生改變［1］，是導(dǎo)致心功能不全、心律失常及慢性心力衰竭難以逆轉(zhuǎn)的最主要病理?yè)p傷之一［2］。心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)是心肌間質(zhì)主要構(gòu)成細(xì)胞，其增殖、表型轉(zhuǎn)換為肌成纖維細(xì)胞并合成分泌大量膠原纖維蛋白。尾加壓素Ⅱ(urotensinⅡ，UⅡ)最早是1985年自硬骨魚(yú)的脊髓尾部神經(jīng)分泌系統(tǒng)分離出來(lái)的一種生長(zhǎng)抑素樣環(huán)肽，屬于神經(jīng)肽范圍［3］。目前研究已證實(shí)，UⅡ能促進(jìn)CFs增殖［4］，但筆者尚未見(jiàn)UⅡ?qū)ζ浔硇娃D(zhuǎn)換作用的報(bào)道。筆者在本研究以培養(yǎng)的新生乳鼠心肌成纖維細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察不同濃度UⅡ?qū)型膠原蛋白分泌及其表型轉(zhuǎn)換的標(biāo)志蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表達(dá)的影響，并研究其對(duì)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)磷酸化的作用，旨在進(jìn)一步探討UⅡ誘導(dǎo)心肌纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 1 d齡新生SD乳鼠，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào):Scxk(鄂)2004-0007。UⅡ、抑肽酶(aprotinin)和亮肽酶素(leupeptin)均為Sigma公司產(chǎn)品、達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基(Dulbecco＇s minimum essential medium，DMEM)培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清(Gibco公司)，小鼠抗大鼠p-ERK1/2單克隆抗體(Santa Cruz公司)。I型膠原(Col I)ELISA試劑盒(上海森雄)。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Biorad公司)，細(xì)胞顯像系統(tǒng)(德國(guó)LEICA DC200)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和試驗(yàn)分組 取1d齡的SD乳鼠，在無(wú)菌條件下開(kāi)胸剪取心室肌，剪碎心肌，0.1%胰蛋白酶消化后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為105個(gè)·mL-1，采用差速貼壁1 h，獲得成纖維細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至近融合狀態(tài)時(shí)按1∶2傳代。傳代后成纖維細(xì)胞純度達(dá)到95%。實(shí)驗(yàn)用第2或第3代的細(xì)胞。按照處理因素不同，分為4組，對(duì)照組，給予0.9%氯化鈉溶液，UⅡ低、中、高劑量組分別給予 10-10，10-9，10-8mol·L-1UⅡ。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測(cè)細(xì)胞上清液中Ⅰ型膠原含量 CFs均勻接種到100mL培養(yǎng)瓶中，放置在37℃、5%二氧化碳(CO2)及飽和濕度條件下培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞將近長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底時(shí)，吸出培養(yǎng)液，對(duì)照組換用無(wú)血清培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集上清液，ELISA法檢測(cè)各組I型膠原含量。

1.2.3 免疫熒光 成纖維細(xì)胞用3.7%多聚甲醛固定。以0.3%的Triton X-100破膜后與異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的 α-SMA 抗體孵育。熒光顯微鏡下觀察免疫熒光標(biāo)記的成纖維細(xì)胞α-SMA表達(dá)。

1.2.4 免疫印跡法檢測(cè) ERK磷酸化和 α-SMA表達(dá) 常規(guī)裂解細(xì)胞提取總蛋白，檢測(cè) p-ERK1/2和 α-SMA表達(dá)。取蛋白50 μg加入上樣緩沖液煮沸3 min變性，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，再電轉(zhuǎn)移至聚二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜，封閉后與 1∶1 000稀釋的一抗4℃孵育過(guò)夜，與1∶20 000稀釋的二抗室溫孵育l h，再與ECL溫浴l min后曝光、顯影和定影，最后對(duì)結(jié)果進(jìn)行吸光度掃描分析。

2 結(jié)果

2.1 UⅡ?qū)π募〕衫w維細(xì)胞上清液Ⅰ型膠原含量的影響 心肌成纖維細(xì)胞經(jīng)不同濃度UⅡ刺激24 h后，ELISA結(jié)果顯示隨UⅡ濃度升高，各組I型膠原合成量升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，見(jiàn)圖1。

2.2 UⅡ?qū)π募〕衫w維細(xì)胞α-SMA表達(dá)的影響 用刺激因素處理24 h后，免疫熒光法測(cè)定心肌細(xì)胞α-SMA表達(dá)見(jiàn)圖2。經(jīng)不同濃度UⅡ作用后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)α-SMA明顯濃集增粗。進(jìn)一步以免疫印跡法測(cè)定α-SMA表達(dá)，見(jiàn)圖3，結(jié)果亦提示UⅡ能明顯提高α-SMA表達(dá)，且各濃度組和對(duì)照組比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05 或 P＜0.01)。

圖1 4組心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原分泌結(jié)果A.對(duì)照組;B.UⅡ低劑量組;C.UⅡ中劑量組;D.UⅡ高劑量組;與對(duì)照組比較，*1P＜0.05，*2P＜0.01Fig.1 Effects of U Ⅱ on the type I collagen of 4 groupsA.control group;B.low dose of UⅡ group;C.medium dose of U Ⅱ group;D.high dose of UⅡ group;Compared with the control group，*1P＜0.05，*2P＜0.01

圖2 4組心肌成纖維細(xì)胞α-SMA表達(dá)的免疫熒光圖A.對(duì)照組;B.UⅡ低劑量組;C.UⅡ中劑量組;D.UⅡ高劑量組Fig.2 EffectsofU IIon α-SMA expressionby immunocytochemistry in 4 groupsA.control group;B.low dose of UⅡ group;C.medium dose of UⅡ group;D.high dose of UⅡ group

2.3 UⅡ?qū)π募〕衫w維細(xì)胞ERK磷酸化的影響 為進(jìn)一步探討UⅡ誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的機(jī)制，用免疫印跡法檢測(cè)各組p-ERK1/2表達(dá)，結(jié)果顯示UⅡ顯著提高p-ERK1/2表達(dá)，與對(duì)照組比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05 或 P＜0.01)。見(jiàn)圖4。

2.4 ERK阻斷劑PD98059對(duì)UⅡ促進(jìn)CFs表型轉(zhuǎn)換的影響 為進(jìn)一步證實(shí)ERK通路在UⅡ誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中起重要作用，檢測(cè)ERK阻斷藥PD98059(2×10-5mol·L-1)對(duì) α-SMA 的表達(dá)，結(jié)果顯示UⅡ(10-8mol·L-1)能顯著提高CFs表型轉(zhuǎn)換標(biāo)志蛋白α-SMA的表達(dá)，以上效應(yīng)能被PD98059明顯減弱，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖5。

圖4 UⅡ?qū)RK磷酸化的影響A.對(duì)照組;B.UⅡ低劑量組;C.UⅡ中劑量組;D.UⅡ高劑量組;與對(duì)照組比較，*1P＜0.05，*2P＜0.01Fig.4 Effects of UⅡ on ERK phosphorylation in 4 groupsA.control group;B.low dose of UⅡ group;C.medium dose of UⅡ group;D.high dose of U II group;Compared with the control group，*1P＜0.05，*2P＜0.01

圖5 PD98059對(duì)UⅡ促進(jìn)CFs表型轉(zhuǎn)換的影響A.對(duì)照組;B.UⅡ組;C.UⅡ+PD98059組;D.PD98059 組;與對(duì)照組比較，*1P＜0.05，與 U Ⅱ組比較，*2P＜0.05Fig.5 Effects of PD98059 on phenotypic transition of cardiac fibroblasts enhanced by UⅡA.control group;B.U Ⅱ group;C.U Ⅱ+PD98059 group;D.PD98059 group;Compared with the control group，*1P＜0.05;Compared to the U Ⅱ group，*2P＜0.05

3 討論

CFs是合成和分泌心臟細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞類型，受刺激后活化，發(fā)生表型和功能的改變，成為表達(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞、過(guò)度增殖并產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)，如Col I等［1-2］。心肌組織、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊以及脂質(zhì)沉積的平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞富含UⅡ，提示UⅡ可能影響心血管的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和病理過(guò)程［5］。此外，研究報(bào)道充血性心力衰竭、心肌肥大患者的血漿UⅡ濃度顯著增高［6-8］。UⅡ還有刺激體外培養(yǎng)的新生鼠心肌纖維原細(xì)胞的原骨膠原αI、αⅢ和纖維原mRNA表達(dá)水平上升［9］。但目前尚無(wú)UⅡ?qū)π募〕衫w維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的影響的相關(guān)報(bào)道。

本研究利用體外培養(yǎng)的新生乳鼠心肌成纖維細(xì)胞，結(jié)果顯示，各濃度UⅡ作用后，心肌成纖維細(xì)胞上清液中Ⅰ型膠原含量顯著提高、胞內(nèi)α-SMA表達(dá)明顯增高濃集。以上結(jié)果提示UⅡ能促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換。進(jìn)一步研究UⅡ能促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)UⅡ能夠明顯上調(diào)ERK活性。ERK是絲裂原活化的蛋白激酶MAPKs之一。ERK途徑是細(xì)胞生長(zhǎng)、分化與存活等過(guò)程的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。ERK通過(guò)磷酸化下游效應(yīng)分子使它們活化，繼而激活作用于下游的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換［10-12］。而給予PD98059后，α-SMA表達(dá)明顯下調(diào)，進(jìn)一步確定ERK通路在UⅡ誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中起重要作用

綜上所述，UⅡ可以明顯地促進(jìn)CFs表型轉(zhuǎn)換為肌成纖維細(xì)胞，并分泌大量I型膠原。ERK途徑在其機(jī)制占有重要地位。后續(xù)研究將著重于UⅡ?qū)RK下游信號(hào)分子的影響。

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