趙詩(shī)萌 魏 兵 吳紅敏 薛辛東

早產(chǎn)兒慢性肺疾?。╟hronic lung disease，CLD）是早產(chǎn)兒長(zhǎng)時(shí)間吸入高濃度氧后最常見(jiàn)的并發(fā)癥，其晚期病理結(jié)局是肺間質(zhì)纖維化，表現(xiàn)為肺成纖維細(xì)胞（lung fibrolast，LF）的過(guò)度增殖[1]。G1/S是細(xì)胞周期的關(guān)鍵性調(diào)控點(diǎn)，高氧通過(guò)抑制G1/S調(diào)控點(diǎn)的作用，促使LF更多地從G1期進(jìn)入S期，導(dǎo)致LF過(guò)度增殖[2]。RB基因是G1/S調(diào)控點(diǎn)的核心，有磷酸化及非磷酸化2種形式，其中RB磷酸化的RB蛋白可能參與對(duì)細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控作用。本研究的主要目的是通過(guò)檢測(cè)CLD鼠不同發(fā)展階段LF總RB蛋白及磷酸化RB蛋白的表達(dá),探討RB基因在CLD鼠肺間質(zhì)纖維化中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年雌性SD大鼠60只，成年雄性SD大鼠15只，清潔級(jí)，體質(zhì)量220～240 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，雌雄交配（4∶1）。將孕22～23 d自然分娩的新生SD大鼠共120只（連同母鼠）隨機(jī)分為空氣對(duì)照組和高氧組，每組60只新生鼠及30只母鼠。高氧組于生后12 h內(nèi)置于玻璃氧箱（60 cm×50 cm×40 cm）中，持續(xù)輸入氧氣，維持吸入氣體氧濃度（FiO2）體積分?jǐn)?shù)在0.85，用鈉石灰吸收CO2，使其體積分?jǐn)?shù)為0.005。溫度22℃～25℃，濕度50%～70%，每天定時(shí)開(kāi)箱30 min，添加水、飼料及更換墊料，并與空氣組交換母鼠以免因氧中毒而導(dǎo)致喂養(yǎng)能力下降?？諝饨M置于同一室內(nèi)空氣中（FiO2的體積分?jǐn)?shù)為0.21），飼養(yǎng)條件與高氧組相同。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肺成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng) 分別于實(shí)驗(yàn)后3、7、14、21 d隨機(jī)處死動(dòng)物后，無(wú)菌條件下采集肺組織，進(jìn)行LF細(xì)胞的原代培養(yǎng)[3]。待細(xì)胞鋪滿瓶底后按1∶2傳代，收集第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)[3]。

1.2.2 免疫組化技術(shù)檢測(cè)總RB及磷酸化RB蛋白表達(dá) 取同代細(xì)胞接種于蓋玻片上，第2天取出蓋玻片用4%多聚甲醛固定。按免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）步驟操作，一抗分別為兔RB單克隆抗體（美國(guó)NEO?MARKERS公司）、羊抗人p-RB絲氨酸（ser）-795多克隆抗體（Santa Cruz公司產(chǎn)品），DAB顯色。顯微鏡下觀察并拍片，每組動(dòng)物各時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)的LF免疫組化爬片隨機(jī)抽取10張，每張片子于光鏡（×400）隨機(jī)取5個(gè)視野，蛋白質(zhì)半定量測(cè)定應(yīng)用美國(guó)Universal Imaging Porporation圖像分析系統(tǒng)，應(yīng)用Me?ta Morph軟件分析陽(yáng)性細(xì)胞的著色強(qiáng)度，以平均積分光密度值表示RB及p-RB產(chǎn)物的強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)值均采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)用±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺成纖維細(xì)胞RB蛋白免疫組化結(jié)果 高氧組與空氣組相比，各時(shí)點(diǎn)RB蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1、圖1。

表1 2組肺成纖維細(xì)胞RB免疫組化光密度值比較（n=10±s）

表1 2組肺成纖維細(xì)胞RB免疫組化光密度值比較（n=10±s）

均P>0.05

組別空氣組高氧組t 3 d 0.256±0.014 0.249±0.021 0.83 7 d 0.250±0.024 0.261±0.022 1.01 14 d 0.257±0.027 0.266±0.033 0.63 21 d 0.256±0.020 0.261±0.037 0.16

2.2 肺成纖維細(xì)胞p-RB蛋白免疫組化結(jié)果 生后3 d時(shí)2組p-RB蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）,生后7～21 d時(shí)高氧組表達(dá)開(kāi)始增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見(jiàn)表2、圖2。

表2 2組肺成纖維細(xì)胞p-RB光密度值比較（n=10±s）

表2 2組肺成纖維細(xì)胞p-RB光密度值比較（n=10±s）

*P<0.05，**P<0.01

組別空氣組高氧組t 3 d 0.089±0.002 0.092±0.005 1.67 7 d 0.095±0.006 0.102±0.004 2.91*14 d 0.089±0.005 0.104±0.008 4.77**21 d 0.091±0.006 0.110±0.007 6.19**

3 討論

真核細(xì)胞分裂增殖必須通過(guò)2個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞周期調(diào)控點(diǎn)：G1/S和G2/M關(guān)卡調(diào)控點(diǎn)。目前對(duì)G1/S調(diào)控點(diǎn)途徑研究得較為深入，RB蛋白是該調(diào)控點(diǎn)的中心?，F(xiàn)已證實(shí)，在多種腫瘤中均可見(jiàn)RB蛋白的表達(dá)異常[4]，其原因一方面可能與RB蛋白自身變異有關(guān),另一方面也可能是由于細(xì)胞周期素依賴激酶的抑制因子,如p16Ink4a的去活化促進(jìn)RB的磷酸化而失活。

Rb基因主要以分子質(zhì)量為110 ku的非磷酸化形式和分子質(zhì)量介于110～116 ku的不同程度的磷酸化形式存在，RB蛋白功能的發(fā)揮依賴激酶和磷酸酶的磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的，其以磷酸化和去磷酸化的形式?jīng)Q定著轉(zhuǎn)錄因子E2F的活性，在細(xì)胞周期調(diào)控中處于中心環(huán)節(jié)，從而控制著細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化[5]。低磷酸化或非磷酸化的RB，可以結(jié)合并抑制E2F轉(zhuǎn)錄因子，阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞增殖。RB蛋白共含有16個(gè)細(xì)胞周期素依賴性激酶的磷酸化位點(diǎn),Rb蛋白的功能狀態(tài)依賴于不同位點(diǎn)的磷酸化，其中ser-795位點(diǎn)磷酸化是從有活性的非磷酸化狀態(tài)向無(wú)活性的磷酸化狀態(tài)轉(zhuǎn)變的標(biāo)志。ser-795可以被cyclin D1/CDK4磷酸化，由此解除了RB介導(dǎo)的對(duì)細(xì)胞周期的抑制[6]。

筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)，高氧可導(dǎo)致新生鼠肺組織P16基因啟動(dòng)子甲基化異常，使肺成纖維細(xì)胞P16基因表達(dá)失活[7]。而當(dāng)P16蛋白低表達(dá)或不表達(dá)時(shí)，cyclin D過(guò)表達(dá)與CDK4結(jié)合，從而使RB蛋白磷酸化而導(dǎo)致其與轉(zhuǎn)錄因子E2F1解離，游離狀態(tài)的E2F1進(jìn)入核內(nèi)結(jié)合一系列具有特殊序列的基因啟動(dòng)子區(qū)，促進(jìn)這些基因的表達(dá)，這些基因產(chǎn)物促進(jìn)細(xì)胞通過(guò)G1/S調(diào)控點(diǎn)，細(xì)胞提前進(jìn)入S期，細(xì)胞生長(zhǎng)失控。為了證實(shí)這一推論，筆者觀察和比較總RB蛋白及磷酸化RB在LF中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高氧及空氣各實(shí)驗(yàn)組肺成纖維細(xì)胞RB蛋白的表達(dá)均無(wú)明顯差異，說(shuō)明高氧不能改變總RB蛋白的表達(dá)。與空氣組相比，生后7 d時(shí)高氧組p-RB表達(dá)開(kāi)始增多，提示高氧可能通過(guò)抑制P16基因的表達(dá)，使得RB蛋白磷酸化，導(dǎo)致RB蛋白功能障礙,解除了RB蛋白對(duì)細(xì)胞周期的抑制，細(xì)胞過(guò)度增殖。

[1]Baraldi E,Fillipone M.Chronic lung disease after premature birth[J].N Engl J Med,2007，357(19):1946-1955.

[2]趙詩(shī)萌，吳紅敏，劉雪雁，等.CLD鼠肺成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及生物學(xué)行為研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2009,19（17）:2561-2564.

[3]Kelleher MD,Naureckas ET,Solway J,et al.Hershenson.In vivo hy?peroxic exposure increase cultured lung fibroblast proliferation and c-Ha-ras expression[J].Am J Respir Cell Mol Biol,1995,12(1):19-26.

[4]Contu SS,Contu PC,Damin DC,et al.pRB expression in esopha?gealmucosa of individuals at high risk for squamous cell carcinoma of the esophagus[J].World J Gastroenterol,2007,13(11):1728-1731.

[5]Dasgupta P,Betts V,Rastogi S，et al.Direct binding of apoptosis sig?nal-regulating kinase 1 to retinoblastoma protein:novel links be?tween apoptotic signaling and cell cycle machinery[J].J Biol Chem,2004,279(37):38762-38769.

[6]Thomas NS,Pizzey AR,Tiwari S,et al.p130,p107,and pRb are dif?ferentially regulated in proliferating cells and during cell cycle ar?restby alpha-interferon [J].JBiolChem,1998,273(37):23659-23667.

[7]Yue X,Fu J,Xue X,et al.Detection of p16 promoter methylation in premature rats with chronic lung disease induced by hyperoxia[J].Pediatr Int,2010，52(4):520-526.