顧榮民 陳環(huán)球 明學志 文旭 俞軍

胃癌是我國常見的惡性腫瘤，臨床診治的胃癌多為進展期胃癌，根治術后最常見的復發(fā)是腹膜轉移，約占總復發(fā)的33%～50%，腹膜轉移是導致患者死亡的主要 原 因 之 一［1－2］。肝 細胞 生 長 因 子 (hepatocyte growth factor，HGF)和編碼其受體的基因 c－Met存在于人類消化道組織中，HGF/c－Met信號通路的異?？梢詫е履[瘤的生成和轉移，c－Met被廣泛認為是腫瘤轉移和早期侵犯的一個診斷指標［3］。最新研究表明，c－Met是胃癌組織中結腸癌轉移相關因子－1(metastasisassociated in colon cancer－1，MACC－1)的一個轉錄產物，在腫瘤樣本中表達的MACC－1是轉移已經形成和尚未形成生存的一項獨立預測指標［4］。本研究通過研究胃癌患者組織中 c－Met mRNA、MACC－1 mRNA 的表達來判斷和預測胃癌患者腹膜轉移可能。

1 資料與方法

1.1 研究對象 45例胃癌及相應癌旁正常組織來自江蘇省腫瘤醫(yī)院2011年1月至2011年7月接受胃大部分切除術的腺癌患者，術前均未接受放療和化療。男31例，女14例，年齡27～71歲，平均(54±3.8)歲。病理均為腺癌，其中高、中分化腺癌共10例，低分化腺癌35例，發(fā)生淋巴結轉移31例，發(fā)生血行及種植轉移3例。按國際抗癌聯盟(UICC)1997年修訂的PTNM分期標準分為Ⅰ期2例，Ⅱ期8例，Ⅲ期18例，Ⅳ期17例，腫瘤直徑≥5 cm者23例，＜5 cm者22例。

1.2 試劑與引物 組織RNA提取試劑盒購自羅氏公司，逆轉錄及熒光定量PCR試劑均購自大連TAKALA生物有限公司。定量PCR引物序列如下:c－Met Forward:5'－AGGCTTGTAAGTGCCCGAAGTGTA－3'，Reverse:5'－TCGGCATGAACCGTTCTGAGATGA－3';MACC－1 Forward:5'－TTCTTTTGATTCCTCCGGTGA－3'，Reverse:5'－ACTCTGATGGGCATGTGCTG－3';內參 β－Actin Forward:5'－AGCGGGAAATCGTGCGTGACA－3'，Reverse:5'－GTGGACTTGGGAGAGGACTGG－3'。引物均委托上海生工公司合成。

1.3 方法 采用TRIzol試劑，在無菌無RNA酶條件下嚴格按照說明書的方法提取總RNA，瓊脂糖電泳鑒定總RNA有無降解，Nano Drop檢測RNA濃度及純度。取1 μg總RNA以 Oligo dT18逆轉錄 cDNA，定量PCR檢測MACC1和C－Met在各組織樣品中的相對表達。定量PCR條件如下:95℃預變性2 min;94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)40次;末次循環(huán)后從55℃至95℃，每隔0.5℃保溫30 s，行熔鏈曲線分析。

1.4 統計學分析 數據以均數±標準差表示，用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析。組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 標準曲線的繪制 以10倍稀釋的cDNA為模板，定量PCR檢測MACC－1和c－Met的擴增曲線、熔鏈曲線、標準曲線以及擴增效率的計算結果:MACC－1擴增效率(E)為 0.95，c－Met擴增效率(E)為 0.99。

2.2 胃癌組織與癌旁組織中 MACC－1、c－Met mRNA表達水平的比較 MACC－1 mRNA在胃癌組織中，相對于內參的表達為(8.52±2.39)×10－4，而癌旁組織中 MACC－1 的相對表達為(6.47 ±1.24)×10－5，MACC－1在腫瘤組織中的表達顯著高于癌旁組織(P＜0.05);c－Met mRNA在胃癌組織中的相對表達為(4.48 ±0.96)×10－1，癌旁組織中 c－Met的表達為(9.36±3.21)×10－5，c－Met在胃癌組織中也明顯高表達(P＜0.05)。

2.3 MACC－1 mRNA和c－Met mRNA陽性表達與胃癌臨床病理參數關系 進一步研究發(fā)現，MACC－1 mRNA和c－Met mRNA與胃癌患者臨床分期、腫瘤直徑大小、浸潤深度、腫瘤的分化程度、淋巴結轉移有關(P均＜0.05)，而與年齡和腫瘤大小無關(P＞0.05)，見表1。相關性分析發(fā)現 MACC－1 mRNA 和 c－Met mRNA在胃癌組織中表達呈正相關關系(r＝0.366，P＜0.05)，見表2。

表1 臨床和病理參數與胃癌組織中MACC－1 mRNA和c－Met mRNA陽性表達和不同陽性表型間的關系(±s，×10－4)

表1 臨床和病理參數與胃癌組織中MACC－1 mRNA和c－Met mRNA陽性表達和不同陽性表型間的關系(±s，×10－4)

注:同一項目不同子項目間比較，*P＜0.05

項目 n MACC－1 mRNA c－Met mRNA性別男31 7.96±3.12 4.29±0.96女14 8.01±2.55 4.50±0.55年齡(歲)≤60 33 8.22±1.98 4.55±1.05＞60 12 8.31±3.54 4.43±0.48腺癌組織分化低度 35 8.79±3.01* 5.10±1.12*高、中度 10 6.02±2.41 3.23±0.88腫瘤大小(cm)≥5 23 8.26±2.66 4.25±0.34＜5 22 8.14±3.14 4.51±0.39淋巴轉移有31 8.91±3.55* 5.97±1.20*無14 6.12±2.98 2.49±0.98 PTNM分級Ⅰ～Ⅱ 10 6.20±2.07 2.35±1.05Ⅲ～Ⅳ 35 9.07±3.25* 5.84±1.33*

表2 胃癌組織中MACC－1 mRNA和c－Met mRNA表達的相關性

3 討論

MACC－1是2009年在 nature雜志上發(fā)表的一個與結腸癌轉移相關的基因，在腫瘤樣本中表達的MACC－1是一項轉移已經形成但是尚未形成生存的獨立預測指標。已經發(fā)現的編碼HGF受體的基因c－Met是 MACC－1 的一個轉錄產物［5］。

HGF又稱分散因子(scatter factor，SF)，是酪氨酸激酶受體 c－Met的配體。HGF/c－Met信號通路是由HGF作用于c－Met，引起一系列信號轉導蛋白的酶促反應，促發(fā)相應生物學效應的信號傳遞路徑［6－8］。HGF/c－Met信號通路能誘導細胞增殖、分散、遷移、器官形態(tài)形成、血管發(fā)生等一系列生物效應，這對組織修復和胚胎發(fā)育起重要作用。然而，HGF/c－Met信號通路的失調會導致細胞的侵襲性生長以及腫瘤的演進和轉移。正常的HGF/c－Met信號轉導在胚胎發(fā)育、組織損傷修復中起重要作用，而異常的HGF/c－Met信號轉導與腫瘤發(fā)生，尤其是侵襲和轉移密切相關。在正常細胞中，原癌基因c－Met mRNA呈低水平表達或不表達，雖然在組織器官切除或損傷后，c－Met的表達會暫時性的增加，但表達水平很快恢復正常狀態(tài)，表明正常細胞有能力通過減少c－Met的表達來控制其對HGF的反應。c－Met的過表達可見于人肝癌、膽管癌、胰腺癌、肺癌、甲狀腺癌、胸膜間質瘤等，尤其是在發(fā)生轉移的腫瘤中，它的作用可能包括影響腫瘤細胞間的黏附、促進細胞外基質降解、誘導血管生成以及促進細胞增殖等［9－12］。

本研究發(fā)現在胃癌組織中MACC－1 mRNA和c－Met mRNA表達率分別為77.33%和78.8%，且呈正相關(r＝0.366，P ＜0.05)，提示在胃癌組織中，MACC－1 mRNA和c－Met mRNA的高表達密切相關，對腫瘤的生長、轉移具有協同作用。在試驗中我們還發(fā)現，兩者均表達陽性的38例胃癌中，臨床分期在Ⅲ期以上、組織學分型為低分化腺癌、有淋巴結轉移的高達25例，浸潤至漿膜層者達26例。在兩者均表達陰性的4例患者，均為高、中分化腺癌，僅1例浸潤至漿膜層，且僅1例臨床分期在Ⅲ期以上及有淋巴結轉移，提示MACC－1 mRNA和c－Met mRNA的共同高表達，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉移密切相關，可能與其更易形成HGF/c－Met信號轉導通路促進胃癌的惡性發(fā)展有關，也有可能是其他因素促進了HGF的分泌及c－Met的表達。由本試驗結果可推斷MACC－1 mRNA和c－Met mRNA在胃癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉移中可能起重要作用，聯合檢測 MACC－1 mRNA 和 c－Met mRNA 有助于胃癌的病情估計及預后判斷。

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