龍志敏 趙 蕾 賀桂瓊 宋 沖 楚亞楠

(重慶醫(yī)科大學神經(jīng)科學研究中心，重慶 400016)

β淀粉樣蛋白(beta-Amyloid protein，Aβ)沉積形成的老年斑(senile plaques，SP)是阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的典型病理特征之一。Aβ來源于腦內β-分泌酶和γ-分泌酶對淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein，APP)跨膜區(qū)的切割。Aβ主要有兩種形式:Aβ40和Aβ42(二者比例為9∶1)，其中Aβ42容易纖維化聚集形成具有毒性的低聚體，Aβ42產(chǎn)生過多極易導致SP的形成以及AD的發(fā)生。由于γ-分泌酶是催化Aβ生成的終末階段，且是決定Aβ40/Aβ42比例的關鍵酶，因此該酶目前已成為AD的潛在性治療靶點〔1〕。現(xiàn)已證實γ-分泌酶是由早老素(Presenilin，PS)、前咽缺陷蛋白(Aph-1)、早老蛋白增強子2(Pen2)和單過性跨膜蛋白(Nicastrin，NCT)四種蛋白亞基構成的一種多蛋白復合體〔2〕，其中PS是γ-分泌酶的活性中心〔3〕，但PS活性受γ-分泌酶其他組分的調控，其中最為密切的是NCT〔4〕。本文以不同發(fā)育階段的APP/PS1雙重轉基因AD模型小鼠和同窩野生型小鼠為研究對象，采用形態(tài)學方法系統(tǒng)研究NCT在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的分布與表達，以期進一步明確NCT的功能及與AD的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 APP/PS1雙重轉基因傳代小鼠的建立 將購于Jackson Lab雄性和雌性的APP/PS1雙轉基因雜合體種鼠B6C3-Tg(APPswe，PSEN1de9)85Dbo/J合籠，交配繁殖。產(chǎn)下的后代用PCR進行基因分型。

1.1.2 試劑 兔抗NCT多克隆抗體(Convance公司);鼠抗PS單克隆抗體(abcam公司);小鼠抗Aβ單克隆抗體:靶向Aβ1～17的6E10，靶向Aβ17～24的4G8(Sigma公司);鼠抗 β-actin 單克隆抗體(Santa Cruz公司);羊抗兔和羊抗小鼠IgG二抗(Jackson Immunoreseach Laboratories，USA);DNA提取試劑盒(Tiangen公司);鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶復合體(SABC)免疫組化試劑盒(北京中杉);二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(Pierce，USA);其他均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 基因分型 對APP/PS1雙重轉基因小鼠進行鑒定。剪子代小鼠鼠尾約0.5 cm，按照試劑盒(Tiangen公司)步驟提取基因組DNA，核酸蛋白測定儀測定濃度后進行PCR擴增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外分析儀下觀察同時出現(xiàn)APP、PS1條帶的即為APP/PS1雙轉基因小鼠。PCR擴增:根據(jù)提供的引物擴增APP和PS1，以β-actin為內對照。APP引物上游:5'-CACCACAGAATCCAAGTCGG-3'，下游:5'-CTTGACGTTCTGGCCTCTTCC-3';PS1引物上游:5'-CAGGTGCTATAAGGTCAT-3'，下游:5'-ATCACAGCCAAGATGAGC-3';β-actin 引物上游:5'-GACAGGATGCAGAAGGAGAT-3'，下 游:5'-TTGCTGATCCACATCTGCTG-3'。PCR 反應條件:94℃ ×5 min→(94℃ 30 s→58℃ 40 s→72℃ 40 s)共35個循環(huán)→72℃ 10 min(－20℃保存PCR產(chǎn)物)。APP基因PCR產(chǎn)物長350 bp，PS1擴增片段長608 bp，β-actin 為446 bp。

1.2.2 動物分組及處理 根據(jù)基因分型結果，APP/PS1基因陽性小鼠為AD模型組，同窩野生型小鼠為對照組。設置5個觀察時間點，分別為出生后 1 d、7 d、21 d、90 d和 180 d，記為P1、P7、P21、P90、P180。

1.2.3 免疫組織化學染色 小鼠腹腔注射2%水合氯醛麻醉成功后開胸，經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛固定后，取腦入多聚甲醛后固定8 h，常規(guī)脫水透明石蠟包埋，然后分別進行冠狀和矢狀切片，厚度4μm。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，微波煮沸抗原修復，自然冷卻，再經(jīng)3%H2O2處理15 min以封閉內源性過氧化物酶活性，5%胎牛血清(BSA)封閉1 h后，加入Ⅰ抗，4℃過夜。Ⅱ抗和SP復合物于室溫孵育2 h。最后用DAB顯色。常規(guī)脫水、透明、封片，光鏡下觀察。

1.2.4 免疫熒光雙標 切片脫蠟后，經(jīng)PBS沖洗3次，然后放入含0.3%TritonX-100的PBS中，室溫浸泡30 min，再用PBS沖洗3次，5%正常山羊血清室溫封閉1 h，然后加入Ⅰ抗:兔抗NCT抗體 (1∶200)及小鼠抗 PS1單克隆抗體(1∶1 000);或兔抗NCT抗體 (1∶200)及小鼠抗Aβ抗體6E10(1∶50)，孵育24 h(4℃)，PBS沖洗3次;加入Ⅱ抗:山羊抗兔 FITC(1∶400)和山羊抗小鼠TRITC(1∶400)，室溫孵育2～4 h;PBS沖洗;甘油封片。激光共聚焦熒光顯微鏡(Carl Zeiss MicroImaging，Inc.)觀察并采圖。陰性對照:免疫組化和免疫熒光染色時，用正常山羊血清代替I抗孵育APP/PS1轉基因小鼠和野生型小鼠腦切片，經(jīng)上述免疫組織化學和免疫熒光染色，未見明顯的特異性免疫陽性反應產(chǎn)物。

2 結果

2.1 APP/PS1雙轉基因癡呆小鼠的鑒定結果 雌性和雄性種鼠產(chǎn)下后代，剪鼠尾提取基因組DNA經(jīng)PCR擴增后，1.5%瓊脂糖電泳結果:同時出現(xiàn) APP條帶(350 bp)和 PS1條帶(608 bp)的即為APP/PS1雙轉基因陽性小鼠。見圖1。

2.2 NCT在成年APP/PS1雙轉基因癡呆小鼠CNS各區(qū)域的分布 取出生后180 d的APP/PS1雙轉基因癡呆小鼠腦和脊髓進行免疫組化，結果顯示:NCT陽性細胞廣泛分布于成年癡呆小鼠CNS各區(qū)域，包括大腦新皮質、嗅腦、海馬、丘腦、紋狀體、小腦、腦干和脊髓等，其中NCT陽性反應主要出現(xiàn)在神經(jīng)元，而未出現(xiàn)在膠質細胞內。癡呆小鼠大腦新皮質的NCT陽性細胞主要分布于第Ⅳ、V層，而表層(I層)出現(xiàn)的NCT陽性細胞少;嗅腦內的NCT陽性細胞主要分布于內皮層的第Ⅱ層;海馬內的NCT陽性細胞主要出現(xiàn)在錐體細胞和顆粒細胞層;中腦黑質區(qū)域出現(xiàn)NCT強陽性反應;隔區(qū)有中等強度的NCT陽性反應;紋狀體和丘腦內僅呈弱陽性表達;小腦內的NCT陽性反應以Purkinje細胞層表達較多，顆粒細胞層表達較弱;腦橋和延髓內的神經(jīng)核團(尤其是運動核)內NCT表達非常明顯;第三、四腦室及側腦室脈絡叢出現(xiàn)NCT強陽性表達;在脊髓灰質前角、后角和側角及灰白質交界的網(wǎng)狀結構內NCT呈強陽性表達，而白質區(qū)域幾乎未見NCT陽性細胞。見圖2。

圖1 APP/PS1雙轉基因小鼠的基因分型電泳圖

2.3 NCT的分布與SP及Aβ分布的關系 免疫組化結果顯示，出生后180 d的成年癡呆小鼠CNS內出現(xiàn)大量SP，其大小和形態(tài)不一，但染色較均勻。其中癡呆小鼠大腦新皮質和海馬內SP體積大、數(shù)量多、密集分布;腦室脈絡叢內可見較多的陽性斑塊;小腦皮質內可見少量散在的SP分布;但腦干和脊髓內未見SP。見圖3。為弄清細胞內NCT與Aβ是否共存，實驗中取成年癡呆小鼠的腦組織進行了免疫熒光雙標。結果顯示:癡呆小鼠腦部各區(qū)均出現(xiàn)大量NCT陽性細胞(綠色熒光)和Aβ陽性細胞(紅色熒光)，但在大腦皮質和海馬內NCT陽性神經(jīng)元的數(shù)量要多于Aβ陽性細胞，且在一些神經(jīng)元內NCT與Aβ出現(xiàn)了共存。見圖4。

2.4 NCT與PS1在成年癡呆小鼠腦組織中的共存 免疫熒光雙標結果顯示:PS1在成年APP/PS1雙轉基因癡呆小鼠腦組織的分布趨勢同NCT的分布高度一致。不同的是，在神經(jīng)元內PS1免疫陽性物在胞漿中表達較強，而NCT免疫陽性物在胞漿、胞膜均有強表達。見圖5。

圖2 NCT在APP/PS1雙轉基因小鼠CNS各區(qū)域的分布

圖3 SP在APP/PS1雙轉基因小鼠CNS各區(qū)域的分布(×100)

圖4 免疫熒光雙標顯示

圖5 免疫熒光雙標顯示

2.5 NCT在不同發(fā)育階段癡呆小鼠及同窩野生型小鼠腦內的動態(tài)分布情況 出生后1 d(P1)的癡呆小鼠和同窩野生型小鼠大腦皮質內NCT陽性神經(jīng)元排列致密，免疫陽性物質主要分布于神經(jīng)元胞體，包括細胞膜、細胞質、核膜和突觸;隨著小鼠的發(fā)育，腦組織單位面積內NCT陽性神經(jīng)元數(shù)量逐漸減少，一部分NCT逐漸被運輸?shù)缴窠?jīng)元的樹突和神經(jīng)纖維網(wǎng)中，NCT免疫陽性物質主要分布于細胞膜、部分細胞質和突起，細胞膜染色較深，細胞質染色較淺。與各年齡段野生型小鼠相比，癡呆小鼠腦內NCT陽性神經(jīng)元的染色深度明顯高于野生型小鼠且癡呆小鼠腦內NCT免疫陽性物質在整個胞質和突觸的分布更明顯。見圖6。

圖6 NCT在不同年齡段APP/PS1雙轉基因及同窩野生型小鼠腦中分布及表達的比較(×400)

3 討論

NCT是2000年YU〔5〕等在純化PS片段時分離出的一種與γ-分泌酶功能和 Aβ產(chǎn)生有關的重要蛋白質。近期研究發(fā)現(xiàn)〔6～8〕，NCT 缺乏會使 γ-分泌酶活性下降、Aβ 產(chǎn)生減少;過度表達的NCT可增加Aβ的生成;NCT胞外功能區(qū)DYIGS基序的人工缺失及人工誘導的突變產(chǎn)物會使Aβ尤其是Aβ42明顯增多。以上研究提示，NCT的結構變異或表達水平的改變將導致Aβ生成量的異常，可能與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關。AD可分為家族性(FAD)和散發(fā)性(SAD)兩種，F(xiàn)AD主要是常染色體顯性遺傳病，僅占全部AD的10%以下，目前已證實APP和PS的突變是引起FAD的主要原因;其余絕大多數(shù)AD屬散發(fā)性，由多因素引起。本實驗采用的是APPswe/PS△E9雙轉基因小鼠模型，APPswe是“瑞典家族”突變，突變發(fā)生在APP編碼序列末端，670、671位點，Lvs與 Met分別被 Asn與 Leu取代;PS△E9是在FAD中發(fā)現(xiàn)的第9外顯子缺失突變。攜帶APPswe和PS1突變基因的小鼠具有AD患者的特征性改變，包括空間學習和記憶障礙、SP沉積、神經(jīng)元丟失及反應性膠質細胞增生，被認為是理想的AD動物模型。

目前關于AD的發(fā)病機制形成了幾種學說，其中較為公認的是“Aβ學說”，該學說認為Aβ產(chǎn)生過多并沉積是引起AD的中心環(huán)節(jié)。Aβ是由APP經(jīng)β-分泌酶(BACE1)和γ-分泌酶相繼作用后產(chǎn)生。據(jù)文獻報道〔9～11〕，無論是AD患者還是轉基因AD模型鼠腦內均出現(xiàn)了BACE1蛋白水平增多、β-分泌酶活性增強，但是否出現(xiàn)γ-分泌酶表達及活性的改變尚未見文獻報道。γ-分泌酶是唯一負責I型跨膜蛋白(如APP、Notch、E-cadherin、ErbB-4等)延伸序列的細胞膜內分裂的膜連蛋白。在γ-分泌酶復合體的四個組件蛋白，第一個被發(fā)現(xiàn)且研究得最透徹的是PS。目前已證實PS1水解生成的PS1 CTF/NTF異二聚體是γ-分泌酶的催化活性中心，PS1的異常突變是引起家族性AD的主要原因。γ-分泌酶中第二個被發(fā)現(xiàn)且與PS1關系最密切的蛋白亞基是NCT，有證據(jù)顯示，NCT上有γ-分泌酶的底物結合位點〔12〕，參與 γ-分泌酶與底物的選擇性結合;最近研究還發(fā)現(xiàn)，NCT的胞外功能區(qū)可識別和結合γ-分泌酶的底物，被稱為γ-分泌酶的底物受體〔13〕。作為γ-分泌酶結合位點兼底物受體的NCT，其表達水平變化勢必影響底物(如sAPP)進入γ-分泌酶的數(shù)量，進而影響產(chǎn)物(如Aβ)的產(chǎn)量?？梢灶A見，通過有選擇性的調節(jié)NCT的表達水平來調控γ-分泌酶活性及Aβ的生成量，有望緩解AD癥狀，達到治療AD的目的。盡管目前國際上對NCT的研究在分子水平取得了不少進展，但關于NCT在AD患者CNS中的分布及表達、NCT的分布與SP及Aβ分布的關系、NCT在AD患者及正常人腦組織中的分布和表達的差異等形態(tài)學方面的研究卻鮮有報道。

NCT主要由成纖維細胞和神經(jīng)元合成，在體內廣泛分布。Hebert等〔14〕發(fā)現(xiàn)小鼠不同組織中 NCT mRNA的表達水平不同。NCT在小鼠肝臟、心臟、腎臟和睪丸中表達最高，骨骼肌表達最少，在腦中表達水平一般，但NCT在CNS各區(qū)域分布的情況如何尚無可知。本實驗取出生后6個月的成年APP/PS1雙轉基因AD模型小鼠的腦和脊髓進行免疫組化染色，結果發(fā)現(xiàn)，NCT廣泛分布于癡呆小鼠腦和脊髓的各個區(qū)域，但不是均勻分布，其中NCT陽性神經(jīng)元在大腦新皮質的第Ⅳ～V層、內嗅皮質第Ⅱ層和海馬的錐體細胞和顆粒細胞層的分布最密集;其次在中腦黑質區(qū)域、隔區(qū)、紋狀體、丘腦、小腦皮質Purkinje細胞層、腦橋和延髓內的神經(jīng)核團(尤其是運動核)、各腦室脈絡叢及脊髓灰質等有較多分布，這一結果與Kodama等〔15〕觀察到的NCT在正常小鼠CNS各區(qū)域分布的結果相似。

與NCT在CNS各區(qū)域的分布相比，神經(jīng)元外的SP在出生后6個月的成年癡呆小鼠CNS中的分布極為局限，主要選擇性分布于大腦新皮質、內嗅區(qū)及海馬等與學習記憶密切相關的區(qū)域，在側腦室脈絡叢及小腦皮質有極少量的分布，而腦干及脊髓內未見SP。既然NCT的分布比細胞外Aβ沉積的范圍廣，那么，在大腦皮質與海馬區(qū)域，NCT是否與神經(jīng)元內的Aβ共存?實驗中通過免疫熒光雙標發(fā)現(xiàn)，在大腦皮質和海馬，NCT陽性神經(jīng)元的數(shù)量仍較Aβ陽性神經(jīng)元的數(shù)量多，幾乎所有Aβ陽性神經(jīng)元能與NCT陽性神經(jīng)元疊加，即神經(jīng)元內的Aβ與NCT出現(xiàn)了共存，但有一部分NCT陽性神經(jīng)元內并未出現(xiàn)Aβ，提示這部分NCT可能未參與Aβ的生成，即NCT除與Aβ的生成、AD的發(fā)生有關外，尚存在其他功能。在γ-分泌酶“四人家庭成員”中，NCT和PS1的關系尤為密切。已有不少研究以正常大鼠或細胞為研究對象，用分子生物學方法觀察到NCT與PS1之間形成了NCT-PS1復合物，且NCT的成熟依賴于PS1〔3〕，那么，在癡呆小鼠腦內，NCT與PS1在分布上有怎樣的關聯(lián)呢?本實驗發(fā)現(xiàn)PS1在癡呆小鼠腦中的分布趨勢同NCT的分布高度一致，只是在神經(jīng)元內的分布，PS偏重在胞質表達，而NCT在胞質、胞膜均有表達，且二者在神經(jīng)元內共存。

為弄清NCT在癡呆小鼠與正常小鼠腦組織中的分布及表達是否存在差異，實驗中取不同發(fā)育階段的APP/PS1雙重轉基因癡呆小鼠及同窩野生型小鼠的腦組織進行了免疫組化，結果發(fā)現(xiàn)，無論是癡呆型還是野生型，新生小鼠腦內的NCT陽性神經(jīng)元在大腦皮質的分布密集;隨著小鼠的發(fā)育，單位面積內NCT陽性神經(jīng)元數(shù)量逐漸減少。不同的是，無論在哪一個年齡段，癡呆小鼠腦神經(jīng)元內的NCT免疫陽性物不僅見于細胞膜和突起，更顯著的是較多的NCT還分布于整個胞質，即細胞膜和細胞質均濃染;而同窩野生型小鼠腦神經(jīng)元內的NCT主要分布于細胞膜周圍，故細胞膜周圍染色較深，而胞質染色極淺甚至不著色。該現(xiàn)象提示，NCT在癡呆小鼠和正常小鼠腦神經(jīng)元內的分布及表達存在差異，那么，這種差異是否與癡呆小鼠腦組織中Aβ的生成有關呢?已有研究表明，NCT最初在內質網(wǎng)中合成，然后向高爾基復合體及細胞膜等轉運。正常情況下，絕大多數(shù)NCT分布于高爾基體外側網(wǎng)絡(Trans-Golgi Network，TGN)，即靠近細胞膜分布;少量分布于內質網(wǎng)、溶酶體、線粒體等位于胞漿內或靠近核膜的細胞器〔16〕。近期研究發(fā)現(xiàn)〔7〕，NCT在亞細胞水平的分布會影響不同形式Aβ的產(chǎn)生:細胞膜富含NCT的細胞主要產(chǎn)生分泌型Aβ，其中以Aβ40為主;而若細胞的線粒體、TGN和溶酶體所含的NCT突變或表達水平增加，則導致細胞內Aβ的產(chǎn)生以Aβ42為主，成為形成SP的罪魁禍首。根據(jù)本實驗的結果，結合相關的文獻報道，推測NCT在癡呆小鼠和正常小鼠腦神經(jīng)元內分布及表達的差異與Aβ的生成及AD的發(fā)生密切相關。但NCT在兩種小鼠腦內的分布及表達為什么會出現(xiàn)這種差異，是由于NCT在合成過程中出現(xiàn)了錯誤折疊、轉運障礙還是NCT的蛋白降解出現(xiàn)了障礙?關于這些問題有待進一步探討。

綜上，本實驗通過形態(tài)學方法發(fā)現(xiàn)，NCT在成年癡呆小鼠CNS各區(qū)域廣泛分布，但在大腦皮質和海馬內的分布最密集;NCT的分布范圍要遠遠比Aβ沉積的范圍廣;在不同發(fā)育階段的癡呆小鼠和同窩野生型小鼠腦內，NCT的表達和分布出現(xiàn)了差異，這種差異可能與Aβ的生成及AD的發(fā)生有關。

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