宋秀麗，李省云，李改芬

（太原師范學(xué)院化學(xué)系，山西 太原 030031）

苯丙氨酸（phenylalanine）又稱α-氨基化肉桂酸，化學(xué)全稱為α-氨基-β-苯丙氨酸，它的應(yīng)用領(lǐng)域比較廣泛，如孟山公司開(kāi)發(fā)了以苯丙氨酸及其衍生物為原料合成手性中間體技術(shù)［1］。目前，對(duì)于苯丙氨酸含量測(cè)定的分析方法主要有：電位滴定法［2］、脫氨酶法［3］、紙層析法［4］、熒光法［5］、雙波長(zhǎng)紫外吸收法［6］、雙酶電極法［7］、毛細(xì)管電泳法［8］和 HPLC［9］等。利用對(duì)苯醌荷移光譜法測(cè)定苯丙氨酸含量的方法還未見(jiàn)報(bào)道。本文選用對(duì)苯醌為電子接受體，研究了苯丙氨酸與對(duì)苯醌形成荷移絡(luò)合物的條件，探討了反應(yīng)機(jī)理，并對(duì)藥物樣品進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果令人滿意。

1 實(shí)驗(yàn)材料

CARY300紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Varian）；HH-6電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠）；92M-202A-DR電子天平（普利賽斯國(guó)際貿(mào)易上海有限公司）；210-酸度計(jì)（意大利Hanna）。

2 方法與結(jié)果

2.1 反應(yīng)機(jī)理的探討

苯丙氨酸分子內(nèi)一個(gè)N原子上的孤對(duì)電子可作為電子給予體，對(duì)苯醌作為電子接受體，在水溶液中形成絡(luò)合物?；跍y(cè)得絡(luò)合物組成比為1∶1，該荷移反應(yīng)可表示如下：

2.2 溶液的制備

苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：在電子天平上準(zhǔn)確稱取0.250 0 g苯丙氨酸（中國(guó)藥品生物制品檢定所）于250 mL的棕色容量瓶?jī)?nèi)，加水適量，振搖使苯丙氨酸溶解，用水稀釋至刻度，搖勻配成濃度為1 g/L的溶液；對(duì)苯醌乙醇溶液：在電子天平上準(zhǔn)確稱取0.250 0 g對(duì)苯醌于250 mL的棕色容量瓶?jī)?nèi)，加無(wú)水乙醇適量，振搖使對(duì)苯醌溶解，用無(wú)水乙醇溶解稀釋至刻度處，搖勻，配成濃度為1 g/L的乙醇溶液；三酸緩沖溶液：在100 mL三酸混合液（磷酸、乙酸和硼酸，濃度均為0.04 mol/L）中，在酸度計(jì)上，用0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為8.5；溴代十六烷基吡啶溶液：在電子天平上準(zhǔn)確稱取20.123 5 g溴代十六烷基吡啶，加500 mL水溶解，振搖至完全溶解即可。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。準(zhǔn)確移取適量苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL比色管中，加對(duì)苯醌乙醇溶液0.9 mL，加表面活性劑溴代十六烷基吡啶溶液2 mL，用三酸緩沖溶液稀釋至刻度，搖勻，在90℃水浴中反應(yīng)30 min，迅速冷卻后，以試劑空白為參比，用1 cm石英比色皿，于339 nm處測(cè)其吸光度。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

2.3.1 吸收光譜 按照實(shí)驗(yàn)方法，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在200 nm～500 nm之間掃描，并繪制吸收光譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，苯丙氨酸與對(duì)苯醌形成的絡(luò)合物在339 nm處一個(gè)有吸收峰，而苯丙氨酸在214 nm處有一個(gè)吸收峰，試劑對(duì)苯醌在259 nm和288 nm處有兩個(gè)吸收峰。

2.3.2 溶劑的影響 選用不同的溶劑，按實(shí)驗(yàn)方法配制溶液，測(cè)定相應(yīng)絡(luò)合物的吸光度，結(jié)果表明，在水與甲醇中反應(yīng)最好，二者吸光度接近，考慮到環(huán)境污染及價(jià)格問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)采用水為溶劑。

2.3.3 溫度和時(shí)間的影響 按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，測(cè)定不同溫度下不同反應(yīng)時(shí)間絡(luò)合物的吸光度。從結(jié)果可以看出，在80℃以下反應(yīng)速度慢，在95℃時(shí)很快達(dá)到平衡，但吸光度值較小，而在90℃時(shí)，在30 min～80 min之間吸光度幾乎不變，說(shuō)明反應(yīng)較徹底且到達(dá)平衡。本實(shí)驗(yàn)選用90℃和30 min。

圖1 吸收光譜圖

2.3.4 酸度的影響 分別用pH值不同的三酸緩沖溶液，按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定其吸光度。實(shí)驗(yàn)表明，在pH=8.5的三酸緩沖溶液中，背景的影響最小，吸光度較大，所以本實(shí)驗(yàn)選用pH=8.5的緩沖溶液。

2.3.5 試劑用量的影響 按照實(shí)驗(yàn)方法改變?cè)噭?duì)苯醌乙醇溶液的用量，結(jié)果表明，對(duì)苯醌的用量為0.9 mL時(shí)，吸光度最大。

2.3.6 表面活性劑的影響 按照實(shí)驗(yàn)方法配制溶液，分別加入不同的表面活性劑，測(cè)定其吸光度，結(jié)果表明，用溴代十六烷基吡啶溶液時(shí)吸光度較大且穩(wěn)定，且溴代十六烷基吡啶溶液用量為2 mL時(shí)吸光度值最大。

2.4 重現(xiàn)性的試驗(yàn)

在選定的最佳條件下，以0.2 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液按實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)測(cè)定10次，計(jì)算得其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%。

2.5 絡(luò)合物穩(wěn)定性試驗(yàn)

在選定的最佳條件下，取適量苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液按照試驗(yàn)方法，測(cè)定吸光度后，每隔一定時(shí)間再測(cè)定其吸光度，結(jié)果表明該絡(luò)合物在100 min內(nèi)吸光度值基本不變，穩(wěn)定性較好。

2.6 工作曲線的繪制

按實(shí)驗(yàn)方法，準(zhǔn)確移取不同量的苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，反應(yīng)后測(cè)定絡(luò)合物的吸光度，并繪制工作曲線，結(jié)果見(jiàn)圖 2。苯丙氨酸含量在 20 μg/mL～60 μg/mL時(shí)符合比爾定律，線性回歸方程為A=0.096 4+0.014 3C（C 的單位為 μg/mL），相關(guān)系數(shù) R=0.999 2，表觀摩爾吸光系數(shù)ε=2.4×103L/（mol·cm），桑德?tīng)栰`敏度 S=0.070 μg/cm2。

2.7 絡(luò)合物組成的測(cè)定

用等摩爾連續(xù)變化法測(cè)定絡(luò)合物的組成，結(jié)果表明，苯丙氨酸與對(duì)苯醌的絡(luò)合比為1∶1。

圖2 絡(luò)合物的吸光度工作曲線

2.8 樣品的測(cè)定及回收率實(shí)驗(yàn)

2.8.1 樣品溶液的配制 在電子天平上準(zhǔn)確稱取0.250 0 g苯丙氨酸（天津市大茂化學(xué)儀器供應(yīng)站）于250 mL的容量瓶?jī)?nèi)，加水適量，振搖使苯丙氨酸溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.8.2 樣品測(cè)定 準(zhǔn)確移取0.2 mL樣品溶液于10 mL比色管中，按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定吸光度，并計(jì)算苯丙氨酸的含量。另用藥典法測(cè)定苯丙氨酸的含量，測(cè)定結(jié)果均列于表1中。經(jīng)F檢驗(yàn)，F(xiàn)=2.37＜F（理論）=19，經(jīng)t檢驗(yàn)，t=1.58＜t（理論值）=2.78，表明這兩組數(shù)據(jù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明本方法與藥典法測(cè)定結(jié)果一致。

表1 藥典法與本法測(cè)定苯丙氨酸含量比較

2.8.3 回收率實(shí)驗(yàn) 按照樣品測(cè)定方法，在樣品中分別加入不同量的苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定回收率。其測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，回收率在99.7%～103.0%之間。

表2 回收率測(cè)定結(jié)果

3 討論

苯丙氨酸是人體必需的八種氨基酸之一，在人體的代謝過(guò)程中具有重要作用。廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化工等行業(yè)。在食品行業(yè)中，苯丙氨酸與天冬氨酸縮合形成阿斯巴甜，已廣泛應(yīng)用于調(diào)味品功能性食品中，它還可以用于焙烤食品中強(qiáng)化了氨基酸且改善食品風(fēng)味。在醫(yī)藥行業(yè)中，它是醫(yī)藥輸液制品的必需成分，還是合成一些藥物的原料或良好載體，如它是合成一些抗癌藥物的中間體，其原理是根據(jù)腫瘤細(xì)胞對(duì)氨基酸的特殊要求，以氨基酸為載體，把抗癌藥物的分子或基因載入腫瘤區(qū)，達(dá)到既能抑制腫瘤成長(zhǎng)又能降低腫瘤細(xì)胞毒性的目的，也是生產(chǎn)腎上腺素、甲狀腺素和黑色素的原料。我們選用對(duì)苯醌為電子接受體，研究苯丙氨酸與對(duì)苯醌形成荷移絡(luò)合物的條件，結(jié)果表明，苯丙氨酸與對(duì)苯醌在pH=8.5的三酸緩沖溶液中，90℃水浴加熱30 min，可以生成穩(wěn)定的荷移絡(luò)合物。此荷移絡(luò)合物的λmax=339 nm，表觀摩爾吸光系數(shù)ε=2.4×103L/（mol·cm），在 20 μg/mL～60 μg/mL 的范圍內(nèi)符合比爾定律，用這種方法測(cè)定的樣品含量，結(jié)果與文獻(xiàn)方法一致。

［1］李翼新，張超.L-苯丙氨酸生產(chǎn)及應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.氨基酸和生物資源，2006，28（2）：51-56.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（二部）［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：364-365.

［3］范長(zhǎng)勝，胡寶龍，楊仁根.苯丙氨酸的脫氨酶法測(cè)定［J］.氨基酸和生物資源，1995，17（3）：33-35.

［4］吳文彥.血清中苯丙氨酸的紙層析測(cè)定法［J］.遺傳學(xué)報(bào)，1979，6（1）：154.

［5］Yamaguchi A，Mizushima Y，F(xiàn)ukushi M，et al.Microassay system for screening newborn for galactosemia with use of a fluorometric microplate reader［J］.Screening，1992，1（1）：49-62.

［6］項(xiàng)雷文，鄭檢兵.雙波長(zhǎng)紫外吸收法測(cè)定L-苯丙氨酸含量［J］.氨基酸和生物資源，2002，24（3）：69.

［7］陳滋青，胡軍，Axel W，等.雙酶電極法測(cè)定L-苯丙氨酸的研究［J］.工業(yè)微生物，2000，30（1）：5-8.

［8］楊莉麗，袁倬斌.高效毛細(xì)管電泳法在芳香族手性氨基酸與年齡的關(guān)系研究中的應(yīng)用［J］.分析化學(xué)，1999，27（9）：1 065-1 068.

［9］Kand’ár R，Záková P.Determination of phenylalanine and tyrosine in plasma and dried blood samples using HPLC with fluorescence detection［J］.Chromatogr B，2009，877（30）：3 926-3 929.