田桂英

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

蒲地藍(lán)消炎顆粒為固體口服給藥制劑，功能為清熱解毒，抗炎消腫。臨床上用于治療癤腫、咽炎、扁桃腺炎等。但其對細(xì)菌有抑菌作用，為了保證微生物限度檢查結(jié)果的真實可靠，應(yīng)消除其抑菌性，以保證藥品受微生物污染的程度被檢出。本實驗建立了蒲地藍(lán)消炎顆粒微生物限度檢查方法，并根據(jù)《中國藥典》要求進(jìn)行了方法學(xué)驗證試驗，驗證試驗結(jié)果符合《中國藥典》2010年版二部附錄微生物限度檢查法的要求。

1 儀器和試藥

培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基(MUG)、膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基。菌種：大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B)63501]、白色念珠菌(Candida albicans) [CMCC(B)98001]、黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(B)98003]，上述菌種均購自中國生物制品檢定所，由本所傳代，保存，本試驗所用菌種均為第3代。新鮮配制的0.9%無菌氯化鈉溶液、pH7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液。薄膜過濾裝置：美國whatman薄膜過濾器。蒲地藍(lán)消炎顆粒(天津隆順榕制藥廠，批號070304、 070306 、070308)。

2 方法和結(jié)果

2.1《中國藥典》方法 鑒于日常工作中已知蒲地藍(lán)消炎片對細(xì)菌有抑制作用，故先采用常規(guī)法和稀釋法同步進(jìn)行了本品細(xì)菌計數(shù)的方法學(xué)驗證試驗。霉菌和酵母菌計數(shù)按常規(guī)法進(jìn)行。

2.1.1菌液制備 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)18 h；取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)24～48 h。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)5～7 d，加入4 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，每制成1 ml含孢子數(shù)為50～100 cfu的孢子懸液。

2.1.2細(xì)菌計數(shù)

2.1.2.1供試品的制備 取本品10 g，加pH7.0的氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 ml，分散均勻，作為1∶10的供試液，常規(guī)法每皿取供試液1 ml，稀釋法取供試液1 ml，等量分注5個平皿中，每皿0.2 ml。

2.1.2.2試驗組 取1∶10的供試液1和0.2 ml分別注入平皿中，再分別加入規(guī)定量的陽性對照菌(約50～100 cfu)，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

2.1.2.3菌液組 取規(guī)定量的上述陽性對照菌(約50～100 cfu)，分別注入平皿中，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

2.1.2.4供試品對照組 取1∶10的供試液1 和0.2 ml分別注入平皿中，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

2.1.3霉菌和酵母菌計數(shù)

2.1.3.1試驗組 取上述1∶10的供試液1 ml置平皿中，同時在每皿中加入規(guī)定量的試驗菌(約50～100 cfu )，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。

2.1.3.2菌液組 取規(guī)定量的試驗菌(約50～100 cfu )于平皿中,傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。

2.1.3.3供試品組 同試驗組供試品處理，不加試驗菌。

2.1.4結(jié)果 本品采用常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)的方法學(xué)驗證試驗，大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌試驗組的回收率均低于70%；采用常規(guī)法進(jìn)行霉菌和酵母菌計數(shù)的方法學(xué)驗證試驗，白色念珠菌、黑曲霉的回收率均大于70%。表明本品對細(xì)菌有較強的抑制作用，常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法都不能消除其抑菌性，但對霉菌和酵母菌無抑制作用，霉菌和酵母菌計數(shù)可按常規(guī)法進(jìn)行，見表1。

表1 常規(guī)法和稀釋法試驗結(jié)果

2.2離心沉淀聯(lián)合薄膜過濾法進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)的驗證試驗

2.2.1試驗組 取本品10 g，加pH7.0的氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 ml，取10 ml置離心管中，先以500 r/min離心3 min，取上清液1 ml薄膜過濾，用pH 7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液200 ml分次沖洗，并在最后一次沖洗液中加入約50～100 cfu的試驗菌，取膜貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。

2.2.2菌液組 取規(guī)定量的試驗菌(約50～100 cfu)，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，按平皿法測定其菌數(shù)。

2.2.3供試品對照組 同試驗組供試品處理，不加試驗菌。

2.2.4稀釋劑對照組 取規(guī)定量的試驗菌(約50～100 cfu )，同供試品處理后，薄膜過濾，用200 ml pH 7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液分次沖洗后，取膜貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。

2.2.5結(jié)果 大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌試驗組的回收率均大于70%，見表2，結(jié)果表明離心沉淀聯(lián)合薄膜過濾法能較好的消除本品對細(xì)菌的抑制作用。

2.3控制菌檢查方法的驗證

2.3.1菌液制備 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)18 h，上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液。

2.3.2大腸埃希菌驗證方法

2．3.2.1試驗組 取上述1∶10的供試液10 ml和規(guī)定量的大腸埃希菌(約50～100 cfu)加入100 ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。

2.3.2.2陰性菌對照組 取1∶10的供試液10 ml和規(guī)定量的金黃色葡萄球菌(約50～100 cfu)加入100 ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，依法檢查。

2.3.2.3陽性對照組 取規(guī)定量的大腸埃希菌(約50～100 cfu)加入100 ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，依法檢查。

2.3.2.4供試品對照組 取1∶10的供試液10 ml置100 ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，依法檢查。

取試驗組、陰性菌對照組、陽性對照組、供試品對照組上述培養(yǎng)物各0.2 ml，分別接種于含5 ml MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，分別于5和24 h在366 nm紫外光下檢視，試驗組管MUG陽性，靛基質(zhì)陽性；陰性菌對照組管MUG陰性，靛基質(zhì)陰性；陽性菌對照組管MUG陽性，靛基質(zhì)陽性。

2．3.2.5試驗結(jié)果 陽性對照組檢出大腸埃希菌，陰性菌對照組未檢出大腸埃希菌，試驗組檢出大腸埃希菌。驗證結(jié)果符合要求。見表3。

表3 大腸埃希菌驗證結(jié)果

2.3.3大腸菌群驗證方法

2.3.3.1試驗組 取上述1∶10的供試液1 ml和規(guī)定量的大腸埃希菌(約50～100 cfu)加入10 ml的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)18～24 h。

2.3.3.2陰性菌對照組 取1∶10的供試液1 ml和規(guī)定量的金黃色葡萄球菌(約50～100 cfu)加入10 ml的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)18～24 h。

2.3.3.3陽性對照組 取規(guī)定量的大腸埃希菌(約50～100 cfu)加入10 ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)18～24 h。

2.3.3.4供試品對照組 取1∶10的供試液10 ml置100 ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，依法檢查。

2.3.3.5試驗結(jié)果 試驗組管和陽性對照組管均有菌生長且產(chǎn)酸產(chǎn)氣，均檢出大腸菌群。陰性菌對照組管和供試品對照組管無菌生長，且不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，未檢出大腸菌群。驗證結(jié)果符合藥典要求，見表4。

表4 大腸菌群驗證結(jié)果

3 討論

微生物污染的監(jiān)控是藥品安全性評價的重要手段，中成藥制劑大多是多種中藥成分經(jīng)煎煮、提取、濃縮而成，其中某一種成分在試驗條件下如果有抑菌作用則干擾整個制劑的微生物檢驗結(jié)果。中成藥制劑中通常含有具有一定抑菌作用的藥物,如牛黃、大黃、黃芩、黃柏、穿心蓮、三七等,這些藥物在處方中由于劑量的大小及來源質(zhì)量的差異,決定了它們在制劑中抑菌作用的強弱。而且具有抑菌作用的中成藥制劑大多是對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有一定的抑菌作用。只有采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄈコ苿┑囊志饔?，使之不影響微生物的檢查結(jié)果，同其他的分析方法一樣，證明所采用的方法是適宜的，才能保證結(jié)果的真實性、客觀性。

蒲地藍(lán)消炎顆粒的主要成分有黃芩、蒲公英、板藍(lán)根等，細(xì)菌計數(shù)先分別采用平皿法和培養(yǎng)基稀釋法驗證，霉菌和酵母菌計數(shù)按常規(guī)法驗證，試驗結(jié)果表明大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均低于70%，白色念珠菌、黑曲霉的回收率均大于70%，表明蒲地藍(lán)消炎顆粒對細(xì)菌有較強的抑制作用，對霉菌和酵母菌無抑制作用，所以霉菌和酵母菌計數(shù)方法可以采用操作簡單的常規(guī)法進(jìn)行。本文針對蒲地藍(lán)消炎顆粒對細(xì)菌的抑制作用，又采用了離心沉淀聯(lián)合薄膜過濾法進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)的驗證試驗，結(jié)果上述3種菌的回收率均大于70%，能較好的消除其抑菌作用，說明該方法合理、有效、可行。