張 宇,烏 恩,王國成

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，呼和浩特 010110； 2.天津天士力研究院化學(xué)藥物研究所，天津 300402)

上世紀(jì)90年代，多肽領(lǐng)域研究進(jìn)入一個嶄新的發(fā)展階段。研究表明，生物體內(nèi)含量極微的活性肽在生命過程中起著重要的調(diào)控作用[1-3]，這些活性肽與生物的發(fā)育、生長代謝、免疫、疾病、學(xué)習(xí)、記憶和衰老都有極其密切的關(guān)系。與傳統(tǒng)藥物相比，活性肽具有藥用活性高、生物利用性好、副作用少等優(yōu)點。因此活性肽的開發(fā)利用引起了各國科學(xué)家包括有機(jī)化學(xué)家、生物化學(xué)家、藥物化學(xué)家、結(jié)構(gòu)化學(xué)家等與生命科學(xué)有關(guān)的科學(xué)家的高度重視，近幾年，其已發(fā)展成為國際市場上的一大類重要藥物[4-6]。目前，得到活性肽的途徑多種多樣，本文主要就合成方面對肽進(jìn)行簡單闡述。

1 肽簡介

兩分子氨基酸經(jīng)脫水以酰胺鍵聯(lián)接生成的化合物稱為肽。肽分子中的酰胺鍵稱為肽鍵[7]。由兩個氨基酸形成的肽叫二肽，三個氨基酸形成的肽叫三肽，肽分子中的每一個氨基酸部分稱為氨基酸殘基，開鏈狀的肽的自由氨基一端稱為肽鏈的氨基末端或N端，另一端則稱為羧基末端或C端。通常把小于10個氨基酸殘基的肽稱為寡肽或小分子肽，10～80(或100)個氨基酸殘基的肽稱為多肽。

在溫和反應(yīng)條件下，肽鍵的形成是通過活化一個氨基酸(A)的羧基部分，第二個氨基酸(B)則親核進(jìn)攻活化羧基部分而形成二肽。如果羧基組分(A)的氨基未保護(hù)，肽鍵的形成則不可控制，可能形成線性肽或環(huán)肽等副產(chǎn)物，與目標(biāo)化合物A-B混在一起。

所以，在肽合成過程中，對不參與肽鍵形成的所有官能團(tuán)必須用暫時、可逆的方式予以保護(hù)，即每一個肽鍵的形成，包括三個步驟：第一步，對縮合反應(yīng)中不參與反應(yīng)的活性部分進(jìn)行保護(hù)；第二步， N-保護(hù)氨基酸的羧基必須先活化為活性中間體，隨后于羧基保護(hù)的氨基酸進(jìn)行縮合形成肽鍵；第三步，對保護(hù)基進(jìn)行選擇性脫除或全脫除。

2 氨基酸保護(hù)

2.1氨基保護(hù)及脫保護(hù) 用于氨基保護(hù)的保護(hù)基數(shù)目很多，按其結(jié)構(gòu)可分為烷氧羰基、?；?、烷基三大類。烷氧羰基是目前應(yīng)用最廣的氨基保護(hù)基。表1列舉了幾種有代表性的烷氧羰基保護(hù)基及脫保護(hù)條件。

2.2羧基保護(hù)及脫保護(hù) 目前已知的大多數(shù)羧基保護(hù)基是由一級、二級，或三級醇制備的酯。表2列舉了幾種常見的羧基保護(hù)基。

表1 氨基保護(hù)基及脫保護(hù)條件

表2 代表性的羧基保護(hù)基

2.3側(cè)鏈官能團(tuán)保護(hù) 在氨基酸縮合反應(yīng)中，由于不少氨基酸的側(cè)鏈上都帶有易參與反應(yīng)的活性基團(tuán)，如羥基、巰基、酚基、胍基、咪唑基、吲哚基等。為了避免副反應(yīng)的發(fā)生，在多肽合成中往往也選用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基將其保護(hù)起來。表3列出了幾個側(cè)鏈官能團(tuán)的常用保護(hù)基及脫保護(hù)條件。

表3 側(cè)鏈保護(hù)基及脫除條件

2.4保護(hù)基的匹配 對于用在一個特定肽合成的各種不同類型的保護(hù)基，保護(hù)基的選擇必須具備正交性，正交的意思就是每一類保護(hù)基的脫除各不相干。因此，為獲得最佳正交性，各個化學(xué)裂解機(jī)制應(yīng)該是不同的。

3 肽鍵的生成方法

3.1酰基疊氮物法 早在1902年，就有人將?；B氮物法引入到肽化學(xué)中，因此，該方法是最古老的縮合方法之一，在肽縮合反應(yīng)過程中，疊氮物法對氨基酸很少發(fā)生消旋作用，因此，該方法一直被肽合成工作者廣泛使用。最近我國學(xué)者李勤耕等[23]利用此種方法成功合成出一系列谷氨酰胺類抗腫瘤化合物。

疊氮法接肽分為三步，首先，羧基部分被甲酯、乙酯、芐酯等保護(hù)的肽在室溫下進(jìn)行肼解生成酰肼，然后酰肼在低溫(-15 ℃以下)和酸性條件下與亞硝酸化物反應(yīng)生成疊氮物，最后用有機(jī)堿調(diào)節(jié)pH 8～9，加入氨基組分完成接肽反應(yīng)。機(jī)理如圖1。

圖1 疊氮法接肽反應(yīng)機(jī)理

除此以外，人們還發(fā)現(xiàn)了一種磷酸酯型縮合試劑DPPA，其可以不經(jīng)肼解，直接由羧基變成疊氮鹽。與傳統(tǒng)疊氮物法相比，由于其不需要酰肼中間體，簡化了反應(yīng)步驟，而且反應(yīng)條件更加溫和，因此受到人們的歡迎。機(jī)理如圖2。

圖2 DPPA接肽機(jī)理

3.2混合酸酐法 該方法是指先將保護(hù)的氨基酸的羧基制成高活性的混合酸酐，之后與氨基縮合生成肽的方法?；旌纤狒ㄊ巧鲜兰o(jì)50年代初期開始發(fā)展起來的，開始使用的制備混合酸酐的試劑主要是二苯基磷酸，然后是苯甲酸，現(xiàn)在應(yīng)用最廣的是氯甲酸烷基酯類，主要有氯甲酸乙酯、氯甲酸異丁酯和氯甲酸異丙酯?；旌纤狒ň哂蟹磻?yīng)速度快、產(chǎn)物純度高、產(chǎn)率高、經(jīng)濟(jì)性好等優(yōu)點，因此備受當(dāng)今藥學(xué)工作者的厚愛。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)宓鵬程等人[24]于2007年成功利用此法合成出了胸腺五肽(TP5)中間體Fmoc-Tyr(t-Bu)-WangResin 。

反應(yīng)過程中，羧基組分首先與氯甲酸異丁酯在低溫下(-15 ℃左右)反應(yīng)生成混合酸酐，然后在叔胺存在的堿性條件下與氨基組分反應(yīng)生成肽。反應(yīng)機(jī)理如圖3所示。

圖3 混合酸酐法接肽機(jī)理

3.3碳二亞胺法 在碳二亞胺法類方法發(fā)展過程中，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)首先用于肽合成，并且得到廣泛應(yīng)用，DCC相對便宜，而且可溶于肽合成常用試劑，但是用DCC作縮合劑會有二環(huán)己基脲(DCU)生成，DCU在水中和有機(jī)溶劑中均有一定的溶解度，致使在產(chǎn)物純化過程中很難將其除盡。為此人們開發(fā)了水溶性的碳二亞胺EDC來代替DCC，反應(yīng)完后只需要用酸或水洗滌即可除去反應(yīng)生成的脲，有效的解決了這個問題。劉國都等[25]在合成活性三肽法氏囊素中也用到此方法。

碳二亞胺類的縮合試劑機(jī)理如圖4，縮合試劑先與羧基組分生成活性中間體，然后再與胺基組分在堿性條件下完成肽鏈增長反應(yīng)。

圖4 碳二亞胺偶合反應(yīng)機(jī)理

3.4酰鹵法 該法類似于有機(jī)化學(xué)方法，用酰氯活化羧基，然后在室溫或低溫條件下形成酰胺，是一種常用的方法。然而，此種方法在試劑應(yīng)用中只用于Fmoc-保護(hù)的氨基酸，原因在于Fmoc在酸性條件下非常穩(wěn)定，而其他保護(hù)基保護(hù)的氨基酸很少用該法進(jìn)行合成，因為多數(shù)學(xué)者認(rèn)為酰氯法“過度活潑”且易發(fā)生消旋等多種副反應(yīng)。

3.5苯并三唑型(BOP族) 以BOP為第一代苯并三唑型的縮合試劑可以說是縮合試劑里的一場革命，因為其接肽的效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于DCC，引起消旋的風(fēng)險也明顯減小。之后，人們又發(fā)現(xiàn)了同類型的縮合試劑HBTU、ByBOP、TBTU等。其共同點就是縮合試劑在有機(jī)堿的參與下先與羧基組分反應(yīng)，生成羧酸的苯并三唑酯活性中間體，然后再與氨基組分反應(yīng)生成目標(biāo)多肽，如圖5所示。

圖5 BOP族縮合試劑接肽機(jī)理

4 結(jié)語

目前, 多肽類藥物涉及激素、神經(jīng)細(xì)胞生長和生殖等各生命領(lǐng)域并有直接影響細(xì)胞分化、神經(jīng)質(zhì)傳遞、腫瘤病變和免疫調(diào)節(jié)等多種重要功能[26]。據(jù)有關(guān)方面報道，2008年，全球多肽類藥物總銷售額已達(dá)750～800億美元，每年還以20%的速度快速增長，肽類藥物已經(jīng)成為國際醫(yī)藥市場上的亮點。鑒于此,本文在查閱大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，對多肽常見的合成方法進(jìn)行了歸納總結(jié),希望以此推動肽類藥物在治療疾病中的應(yīng)用。

1 Sun Guoying, Guan Chaxiang, Zhou Yong.Vasoactive intestinal peptide re-balances TREM-1/TREM-2 ratio in acute lung injury. Regulatory Peptides, 2011, 16(7):56

2 Ao Xiaoxiao, Fang Fang, Xu Feng.Vasoactive intestinal peptide protects alveolar epithelial cells against hyperoxia via promoting the activation of STAT3. Regulatory Peptides, 2011,168(1-3):1

3 Yoshitaka Umetsu, Takeshi Tenno. Structural difference of vasoactive intestinal peptide in two distinct membrane-mimicking environments. Biochimica et Biophysica Acta, 2011, 1814(5):724

4 李偉.多肽藥物——醫(yī)藥市場的亮點．上海醫(yī)藥，2004，25(4)：119

5 余志紅，魯憬莉，向明.生物肽的臨床應(yīng)用及現(xiàn)狀分析. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29(23):2034

6 A. Mahmoudia, K. Nazari, M. Khosraneha.Can amino acids protect horseradish peroxidase against its suicide-peroxide substrate . Enzyme and Microbial Technology, 2008,43(4-5): 329

7 Yingwei Chiang, Wang Tzuhsien, Wenchien Lee. Chitosan coating for the protection of amino acids that were entrapped within hydrogenated fat.Food Hydrocolloids, 2009,23(3):1057

8 Ernesto M. Arbeloa , Mario O，Carignan ,etal. Mycosporine-like amino acid content in the sea anemones Aulactinia marplatensis, Oulactis muscosa and Anthothoe chilensis .Comparative Biochemistry and Physiology, 2010, 156 (3):216

9 Mario O, Carignan, Karina H M，etal.Palythine-threonine, a major novel mycosporine-like amino acid (MAA) isolated from the hermatypic coral Pocillopora capitata.Journal of Photochemistry and Photobiology, 2009,94(3): 191

10 Zhana Kravchuka, Begonya Vicedo, Victor Flors，etal.Priming for JA-dependent defenses using hexanoic acid is an effective mechanism to protect Arabidopsis against B. cinerea.Journal of Plant Physiology, 2011,168(4): 359

11 Linda K, Friedman, Menahem Segal. Early exposure of cultured hippocampal neurons to excitatory amino acids protects from later excitotoxicity.Int J Devl Neuroscience, 2010,28 (2) :195

12 R Rink, A ArkemaMeter, I Baudoin,etal. To protect peptide pharmaceuticals against peptidases.Journal of Pharmacological and Toxicological Methods,2010,61 (2): 210

13 Timm Trenktrog, Bernd W， Miiller. Preparation and characterization of a peptide containing w/o emulsion.International Journal of Pharmaceutics,1995,123 (1-2): 199

14 Xiangling Yin, Jill Wright, Trevor Wall,etal. Brain Endothelial Cells Synthesize Neurotoxic Thrombin in Alzheimer’s Disease.The American Journal of Pathology, 2010,176(3):211

15 Atsushi Maeda, Takayuki Mizuno, Masanori Bunya，etal. Characterization of Novel Cholesterol Esterase from Trichoderma sp.AS59 with High Ability to Synthesize Steryl Esters. Journal of bioscience and bioengineering, 2008,105(4)：341

16 Jin Jing, Huang Wenlong, Rao Guangling. Total Synthesis of MC2-a Peptide from Momordica Charantia and Its Hypoglycemic Activity.Chinese Journal of Natural Medicines，2011, 9(1): 58

17 H L Trivedi, A V Vanikar, U Thakker，etal. Human Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Combined With Hematopoietic Stem Cell Transplantation Synthesize Insulin.Transplantation Proceedings, 2008,40(3):1135

18 Eun Ju Oh, Kitae Park, JunSub Choi，etal. Synthesis, characterization, and preliminary assessment of anti-Flt1 peptide-hyaluronate conjugate for the treatment of corneal neovascularization.Biomaterials, 2009,30 (30) :6026

19 Tomas Radzvilavicius,Arunas Lagunavicius.Selective inactivation of M-MuLV RT RNase H activity by site-directed PEGylation: an improved ability to synthesize long cDNA molecules.New Biotechnology, 2011,3(2)：12

20 Jian Chen, Bei Zhang, Cao Xie，etal. Synthesis of a highly hydrophobic cyclic decapeptide by solid-phase synthesis of linear peptide and cyclization in solution .Chinese Chemical Letters ，2010，21 (4):391

21 Y Yoshihara M D, A Plaas, B Osborn B S k,etal. Superficial zone chondrocytes in normal and osteoarthritic human articular cartilages synthesize novel truncated forms of inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chains which are attached to a chondroitin sulfate proteoglycan other than bikunin.Osteoarthritis and Cartilage,2008,16 (2) 16:1343

22 Jiapei Wang, Jianen Hu, Jinzhe Cui，etal.Purification and identification of a ACE inhibitory peptide from oyster proteins hydrolysate and the antihypertensive effect of hydrolysate in spontaneously hypertensive rats.Food Chemistry, 2008,111 (2):302

23 李勤耕，駱永鵬, 陳捷，等.疊氮法合成谷氨酰胺類化合物及其抗腫瘤活性.重慶大學(xué)學(xué)報，2002,25(5):159

24 宓鵬程，朱頤申，張琪，等.固相合成胸腺五肽(TP5).有機(jī)化學(xué)，2007,27(12):1525

25 劉國都，周樂.活性三肽法氏囊素的液相合成.西北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008,17(1):46

26 陳貫虹，遲建國，邱維忠，等. 多肽藥物的研究進(jìn)展. 山東科學(xué)，2008,21(3)：42