劉凌云 李 欣 李 雯
(上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,上海 200090)
一氧化氮(nitric oxide,NO)是一種具有獨(dú)特理化性質(zhì)和生物學(xué)活性的信息和效應(yīng)分子,兼有信使物質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)的功能,在神經(jīng)系統(tǒng)參與多種生理及病理過程的整合[1]。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)陽性神經(jīng)元廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)包括海馬在內(nèi)的腦區(qū)與核團(tuán)。以往研究證實(shí)大鼠足底注射甲醛溶液后,除引起舔、咬注射側(cè)腳掌等疼痛反應(yīng)外,還導(dǎo)致大鼠海馬NOS表達(dá)增加,NO產(chǎn)生增多[2]。小鼠側(cè)腦室內(nèi)注射NOS抑制劑L-NAME能夠明顯減輕甲醛誘導(dǎo)的疼痛反應(yīng),進(jìn)一步證實(shí)NO在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疼痛整合過程中的重要作用[3]。但是,NO生成增加的機(jī)制尚未完全闡明。
大量研究證實(shí),外周應(yīng)用興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)可導(dǎo)致機(jī)械痛覺過敏和自發(fā)痛,鞘內(nèi)注射興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)可誘發(fā)自主傷害性行為和痛覺過敏,興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)通過作用于脊髓后角神經(jīng)元N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體將傷害性信息傳遞致中樞神經(jīng)系統(tǒng),NMDA受體參與脊髓水平傷害性傳入信息整合處理[4]。但是,在海馬水平NOS表達(dá)增加,NO產(chǎn)生增多是否和NMDA受體活動(dòng)有關(guān),尚未見相關(guān)報(bào)道。因此,本研究通過觀察海馬內(nèi)注射NMDA受體拮抗劑MK-801對(duì)甲醛炎性痛過程中海馬NO含量變化情況,以深入探討其內(nèi)在機(jī)制。
一氧化氮試劑盒購自南京建成生物工程公司。還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸、氯化硝基四氮唑藍(lán)、MK-801均購自美國(guó)sigma公司。
大鼠右側(cè)后掌底面皮下注射5%甲醛溶液0.2mL構(gòu)建疼痛模型。
選用健康雄性SD大鼠28只,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體質(zhì)量260~280g。
①甲醛組(F):于大鼠右后掌皮下注射5%甲醛溶液0.2mL,注射甲醛溶液12h后,斷頭開顱取腦,分離雙側(cè)海馬,液氮凍存;②甲醛+MK-801組(F+MK-801):預(yù)先于大鼠雙側(cè)海馬內(nèi)各注射2μL MK-801(20nmol)溶液,15min后右后掌皮下注射5%甲醛溶液0.2mL,于注射甲醛溶液12h后,斷頭開顱取腦,分離雙側(cè)海馬,液氮凍存。③甲醛+生理鹽水組(F+NS):預(yù)先與大鼠雙側(cè)海馬內(nèi)各注射2μLNS,15min后右后掌皮下注射5%甲醛溶液0.2mL,于注射甲醛溶液12h后,斷頭開顱取腦,分離雙側(cè)海馬,液氮凍存;④對(duì)照組(Control):不加任何處理,直接斷頭開顱取腦,分離雙側(cè)海馬,液氮凍存。
大鼠以10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉后,江灣Ⅰ型C立體定位儀固定頭部,剪開頭皮,暴露頭骨,依據(jù)George Paxions& Charles Watson大鼠腦立體定位圖譜,于雙側(cè)海馬(A:3.0,LR:1.8,H:3.0)分別埋置不銹鋼套管,以牙科水泥固定于顱骨上。術(shù)后應(yīng)用抗生素3d預(yù)防感染,分籠單獨(dú)飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)甲醛+MK-801組采用微量注射器緩慢(0.5μL/min)注射2μL MK-801(20nmol),留針5min后慢慢退出。甲醛+生理鹽水組相同部位注射等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后注入滂天藍(lán)(20g/L)核對(duì)注射部位。
采用硝酸還原酶法進(jìn)行NO含量測(cè)定。蛋白定量用考馬斯亮蘭法。實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說明進(jìn)行。
足底注射甲醛溶液大鼠即出現(xiàn)早期的疼痛反應(yīng),如舔、搖動(dòng)足掌,后掌抬離盒底面等行為學(xué)改變。
甲醛組與甲醛+生理鹽水組海馬NO含量與對(duì)照組比較均明顯升高(P<0.01),甲醛組與甲醛+生理鹽水組海馬NO含量比較二者之間無顯著差異。與甲醛組相比,甲醛+MK-801組海馬組織NO含量明顯降低(P<0.01)。同組的左右兩側(cè)海馬NO含量比較無顯著性差異(Tab.1)。
Tab.1 Changes in NO content of hippocampus after right hind paw injection of formalin(±s, n=7)
Tab.1 Changes in NO content of hippocampus after right hind paw injection of formalin(±s, n=7)
*P<0.05 vs control group, #P<0.05 vs formalin group
Group NO content of hippocampus (μmol/g prot)Left Right Control 8.10±0.37 7.91±0.39 F 12.16±0.62* 12.22±0.70*F+NS 12.27±0.43* 12.48±0.71*F+MK-801 9.06±0.46# 8.75±0.61#
有研究報(bào)道,急性束縛與制動(dòng)應(yīng)激可以引起大鼠海馬興奮性氨基酸谷氨酸含量增加[6],強(qiáng)迫游泳應(yīng)激可誘導(dǎo)海馬內(nèi)NOS表達(dá)增加及NO含量明顯升高[7]。因此,本研究認(rèn)為足底注射甲醛溶液引起的組織損傷可引起劇烈疼痛,炎性疼痛也可作為一種刺激引起機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng),通過多種上行神經(jīng)傳導(dǎo)通路,將傷害性信息傳入到海馬,引起海馬內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)大量釋放,作用于海馬神經(jīng)元上的相應(yīng)受體,激活神經(jīng)元內(nèi)一系列信號(hào)傳導(dǎo)途徑,引起NO產(chǎn)生的增多。
興奮性氨基酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),主要包括谷氨酸及天門冬氨酸,其通過與相應(yīng)的受體結(jié)合參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞。NMDA受體是一種重要的興奮性氨基酸受體,廣泛分布與脊髓背角神經(jīng)元。大鼠鞘內(nèi)注射谷氨酸或天門冬氨酸可誘發(fā)疼痛行為反應(yīng)[8];鞘內(nèi)注射NMDA受體拮抗劑可抑制由結(jié)扎坐骨神經(jīng)、皮下注射角叉菜膠所引起的疼痛反應(yīng)[9]。這說明在脊髓水平,NMDA受體的激活在疼痛信息整合過程中發(fā)揮重要作用,而在海馬水平NMDA受體的活動(dòng)是否參與疼痛信息處理尚無明確定論。本研究發(fā)現(xiàn),海馬內(nèi)注射MK-801阻斷NMDA受體的活動(dòng)后,與甲醛12h組相比,MK-801組海馬NO含量明顯降低。以上結(jié)果提示,甲醛炎癥性疼痛過程中,海馬組織NO代謝產(chǎn)物含量的增加可能與NMDA受體的活動(dòng)有關(guān)。并且國(guó)外已有研究證實(shí),海馬齒狀回內(nèi)注射競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體拮抗劑可以產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng),顯著減輕甲醛引起的疼痛反應(yīng),支持本實(shí)驗(yàn)結(jié)果[10]。
總之,本研究認(rèn)為,NMDA受體參與了疼痛過程中海馬NO生成增加,NMDA受體與疼痛信息整合密切相關(guān),采取措施阻斷興奮性氨基酸受體有望減輕疼痛,為開發(fā)有效、安全的臨床新藥提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
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