陳波，張虹，曹純潔

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

近年來(lái)，隨著冠心病介入治療技術(shù)的快速發(fā)展，實(shí)現(xiàn)冠脈再通已經(jīng)不是難題，但是心肌缺血再灌注后不可逆性損傷及心肌缺血、壞死，心肌超微結(jié)構(gòu)的改變都嚴(yán)重影響急性冠脈綜合征(ACS)的預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)，MMPS是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)代謝過(guò)程中重要的蛋白酶，可以降解ECM，不僅削弱纖維帽的結(jié)構(gòu)，增加粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性，加速斑塊破裂和促進(jìn)血栓形成，還可促進(jìn)心肌梗死后膠原纖維沉積，參與心室重構(gòu)，影響心功能，其中MMP－9作用明顯。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在心肌缺血數(shù)分鐘內(nèi)MMP－9表達(dá)即上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物心肌缺血再灌注損傷模型的心肌病理組織學(xué)改變及MMP－9表達(dá)的變化探討以抗凝護(hù)心Ⅱ號(hào)對(duì)心肌缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)Wistar大鼠50只(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體質(zhì)量(250±20)g，雌雄各半。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用藥

抗凝護(hù)心Ⅱ號(hào):由川芎、黃芪、桃仁、紅花、當(dāng)歸、赤芍、黨參、川牛膝、地龍、水蛭、枳殼等組成，藥材均購(gòu)自黑龍江省藥材公司，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院煎藥室煎煮濃縮而成。

通心絡(luò)膠囊:石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供。批號(hào)(080822)。

1.1.3 主要儀器及設(shè)備

心電機(jī)(6511型，上海KOHDEN電子有限公司);小動(dòng)物呼吸機(jī)(DH－50型，浙江大學(xué)醫(yī)療儀器廠生產(chǎn));電子分析天平(梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司);低溫冰箱(MDF－U50V日本三洋公司產(chǎn)品);AO輪轉(zhuǎn)式電機(jī)(徠佧2135型，德國(guó));恒溫水浴箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠);顯微攝像顯微鏡(Olympus B×60，日本);圖像分析系統(tǒng)(麥克奧迪公司 MED 6.5，中國(guó)廈門(mén))。

1.1.4 主要試劑及溶液

anti－matrix metalloproteinase－9試劑(武漢博士得生物工程有限公司提供);PV－6001 Power Vision 9(2－step)(北京中杉生物技術(shù)有限公司);DAB顯色試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司);EDTA二鈉、抑肽酶藥盒(武漢博士得生物工程有限公司提供);0.9%生理鹽水(黑龍江哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)081001);麻醉劑(20%烏拉坦溶液5ml/kg);乙醇、蒸餾水、二甲苯溶液、蘇木素液、3%H2O2溶液(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科提供);PBS緩沖液 (自配，蒸餾水 200ml，Na2HPO4·12H2O 5.802g，NaH2PO4·2H2O 0.592 8g，溶于 2 000mL 水中成0.01 MPB液，加入NaCl 117mg，用NaOH滴定，pH=6.3);固定液T(10%甲醛溶液)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

50只清潔級(jí)Wistar大鼠，隨機(jī)分為5組，假手術(shù)組、模型組、抗凝護(hù)心Ⅱ號(hào)高劑量組、抗凝護(hù)心Ⅱ號(hào)低劑量組、通心絡(luò)組，每組各10只，相同條件下分籠飼養(yǎng)。

1.2.2 給藥方法

5組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別按下列劑量給藥14天。

假手術(shù)組:每天灌服生理鹽水10mL/kg。模型組:每天灌服生理鹽水10mL/kg。抗凝護(hù)心Ⅱ號(hào)高劑量組:每天灌服0.72g/mL抗凝護(hù)心Ⅱ號(hào)，10mL/kg?？鼓o(hù)心Ⅱ號(hào)低劑量組:每天灌服0.24g/mL抗凝護(hù)心Ⅱ號(hào)，10mL/kg。通心絡(luò)組:每天灌服0.05g/mL通心絡(luò)，10mL/kg。

1.2.3 模型建立［1－2］

按上述給藥方法灌胃14天后，于末次灌胃30min后手術(shù)造模。

1.2.4 組織學(xué)切片標(biāo)本及MMP－9免疫組化染色

造模結(jié)束后，處死大鼠，在心底部將心臟與大血管及組織分離，切取壞死心肌組織分成兩部分，用中性福爾馬林固定24h，逐級(jí)梯度乙醇脫水(50%乙醇12h，70%乙醇12h，80%乙醇2h，90%乙醇1.5h，95%乙醇1.5h，100%乙醇2次，分別為 1h，1.5h)，然后石蠟包埋，連續(xù)切取5μm厚度切片，分別進(jìn)行HE染色，免疫組化測(cè)定，光鏡下觀察心肌變化。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組內(nèi)比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間比較用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，非配對(duì)兩兩比較用ANOVA法后再多重比較，所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(±s)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 病理組織學(xué)改變

假手術(shù)組:基本無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞排列成束，界限清晰，細(xì)胞核形態(tài)、大小正常，胞漿染色均勻(見(jiàn)圖1)。

圖1 假手術(shù)組HE染色圖片

模型組:大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(以PMNs為主)，細(xì)胞高度水腫，界限不清，核濃縮或溶解，胞漿淡染，內(nèi)有紅染顆粒，空泡樣變，甚至崩解壞死(見(jiàn)圖2)。

圖2 模型組HE染色圖片

藥物組:其改變程度依低劑量組(圖3)、通心絡(luò)組(圖4)、高劑量組(圖5)的順序減輕，出現(xiàn)不同程度的散在的PMNs浸潤(rùn)，心肌缺血及心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。

圖3 ACⅡ低劑量組HE染色圖片

圖4 通心絡(luò)組HE染色圖片

圖5 ACⅡ高劑量組HE染色圖片

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠MMP－9的比較(±s)

表1 各組大鼠MMP－9的比較(±s)

注:與模型組比較，#P＜0.01;與假手術(shù)組比較，△P＜0.01;與低劑量組比較，*P＜0.01;與通心絡(luò)組比較，☆P＞0.05。

模型組10 14.45 ±1.20假手術(shù)組 10 0.99 ±0.28#通心絡(luò)組 8 3.42 ±0.85#△＊中藥低劑量組 10 10.65 ±1.17#△中藥高劑量組 10 3.31 ±0.73#△＊☆

如表1所示，模型組MMP－9與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說(shuō)明缺血再灌注損傷后大鼠心肌組織MMP－9明顯升高;抗凝護(hù)心Ⅱ號(hào)高、低劑量組、通心絡(luò)組與模型組對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說(shuō)明抗凝護(hù)心Ⅱ號(hào)、通心絡(luò)可降低受損心肌MMP－9的含量，對(duì)心肌組織有明顯的保護(hù)作用;抗凝護(hù)心Ⅱ號(hào)高劑量組、通心絡(luò)組與低劑量組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明抗凝護(hù)心Ⅱ號(hào)高劑量組、通心絡(luò)組比低劑量組更能降低受損心肌MMP－9的含量;抗凝護(hù)心Ⅱ號(hào)高劑量組與通心絡(luò)組對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明抗凝護(hù)心Ⅱ號(hào)與通心絡(luò)組無(wú)明顯差異。

3 討論

細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是血管壁的主要成分，其降解貫穿于ACS發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過(guò)程。而MMPs是一組可降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要蛋白酶類(lèi)，可通過(guò)降解纖維膜成分而加速斑塊的破裂，同時(shí)引起ECM退化，導(dǎo)致心肌排列紊亂，收縮功能異常。MMP－9是MMPs中的一種，由活化的巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等以蛋白酶原前體形式由細(xì)胞內(nèi)分泌到細(xì)胞外，其作用底物有明膠、Ⅳ型、Ⅴ型膠原等。在人類(lèi)動(dòng)脈硬化的斑塊肩部及巨噬細(xì)胞聚集區(qū)顯示了MMP－9的表達(dá)增高，且所有的斑塊抽提物被證實(shí)含明膠酶的活化形式，活化MMP－9的過(guò)表達(dá)可使內(nèi)皮細(xì)胞的ECM降解增強(qiáng)，從而降低斑塊的強(qiáng)度，促使斑塊破裂。斑塊破裂后導(dǎo)致的局部血栓形成使硬化動(dòng)脈造成的狹窄進(jìn)一步加重，從而對(duì)缺血的心肌造成了損傷。本實(shí)驗(yàn)心肌梗死模型組亦顯示心肌缺血再灌注損傷后心肌表達(dá)為明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，體現(xiàn)為心肌細(xì)胞缺血缺氧導(dǎo)致的急性心肌梗死甚至在反復(fù)的缺血缺氧情況下形成的心肌纖維化，從而導(dǎo)致心肌超微結(jié)構(gòu)的改變，心功能的下降。

目前已有多個(gè)流行病研究證明，血清中MMP－9的濃度增加與將來(lái)冠狀動(dòng)脈事件發(fā)生的危險(xiǎn)程度呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示，缺血再灌注損傷后大鼠心肌組織MMP－9明顯高于假手術(shù)組，藥物組MMP－9濃度明顯低于模型組(P＜0.01)，其中高劑量藥物組比低劑量藥物組的MMP－9濃度更低，且心肌超微結(jié)構(gòu)的改變?cè)诟邉┝克幬锝M比低劑量藥物組更小，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度更輕，不僅可以證實(shí)MMP－9組織濃度與心肌受損程度相關(guān)，還證明了抗凝護(hù)心Ⅱ號(hào)在心肌缺血再灌注損傷后對(duì)心肌具有一定的保護(hù)作用。

曾有觀察表明，不同活血藥可作用于ACS的不同環(huán)節(jié)，其穩(wěn)定斑塊作用亦有所差別，干預(yù)炎癥反應(yīng)為其重要作用機(jī)制之一［3－4］。本實(shí)驗(yàn)用藥抗凝護(hù)心Ⅱ號(hào)為中藥復(fù)方，以往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，該方可較好的降低血漿ET、TXB2(血栓素)含量，升高NO含量，提高TPA活性，降低PAI(纖維蛋白原激活劑抑制劑)活性，從而降低血液高凝狀態(tài)、提高纖溶水平、緩解血管痙攣收縮，穩(wěn)定血管內(nèi)皮功能，防止心肌再灌注損傷，避免發(fā)生再梗。本方中川芎、紅花、桃仁等具有活血化瘀功效，黃芪具有益氣、扶正、改善受損血管內(nèi)皮的作用，考慮本藥對(duì)缺血再灌注損傷的心肌組織的保護(hù)可能與減少M(fèi)MP－9的分泌、減少心肌組織的炎性反應(yīng)有關(guān)，也進(jìn)一步證實(shí)了抗凝護(hù)心Ⅱ號(hào)在急性心肌缺血中具有心肌保護(hù)作用。

［1］周敏，姜璟瑛，段玉敏.仙脈通膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血大鼠心肌組織中 NO、NOS的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2010，38(4):29－31.

［2］趙宇輝，孫忠人，魏運(yùn)芳.針灸預(yù)處理對(duì)缺血再灌注大鼠心肌Bcl－2mRNA和BaxmRNA基因表達(dá)的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2009，37(1):16－18.

［3］文川，徐浩，黃啟福，等.活血中藥對(duì)ApoE基因缺陷小鼠血脂及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊炎癥反應(yīng)的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，25(4):345－349.

［4］文川，徐浩，黃啟福，等.幾種活血中藥對(duì)ApoE缺陷小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊影響的形態(tài)學(xué)研究［J］.中國(guó)病理生理雜志，2005，21(8):864－867.