于德君，孫衛(wèi)兵，楊 帆

(1.大連市第四人民醫(yī)院 外一科，遼寧 大連 116031；2.大連醫(yī)科大學 附屬第二醫(yī)院 泌尿外科，遼寧 大連 116027)

泌尿系結石是人類的常見病和多發(fā)病，確切的病因不十分明確。結石成分以草酸鈣多見，占所有結石的75%，所以許多學者多以草酸鈣結石模型來研究成因。自上世紀三十年代提出Randall斑學說以來，研究者們又陸續(xù)提出了多個學說來探討結石的成因。有學者發(fā)現(xiàn)高濃度的草酸和/或一水草酸鈣(COM)結晶對腎小管上皮細胞有毒性作用，腎上皮細胞損傷是結石形成的最早期的基礎病變，是結石形成階段的必要條件之一[1-2]。草酸和草酸鈣結晶對腎細胞產生毒性后，會導致主要由腎臟產生并分泌到尿路中的大分子物質，如骨橋蛋白(OPN)、TH蛋白、CD44、尿凝血酶片段-1等的基因和產物表達增加，它們能夠調節(jié)腎內結晶的成核、生長、聚集和滯留。而OPN與其受體CD44作用，能介導一系列細胞與細胞、細胞與基質之間的反應，繼而引起吞噬了結石晶體的巨噬細胞出現(xiàn)趨化運動，從而導致結石的形成[3]。但OPN在整個結石形成初期及后期的變化，與CD44的關系及是否為唯一的介導因子尚不十分明確。本實驗通過構建高草酸尿癥大鼠的模型，對OPN和CD44在腎小管上皮細胞、基底膜和間質處的表達進行研究，探討OPN和CD44在結石形成過程中的關系。

1 材料和方法

1.1 實驗性高草酸尿癥大鼠模型的構建[4]

將35只雄性SD大鼠(200～250 g ，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供)隨機分成7組，每組5只。對照組：以單蒸水和標準顆粒飼料適應性喂養(yǎng)。實驗組(6組)：以含0.5%乙二醇和0.5%氯化氨的單蒸水為飲用水，標準顆粒飼料分別喂養(yǎng)3、5、7、14、21、28 d。所有大鼠平均每只每天限水30 mL。

1.2 動物模型的取材

常規(guī)處死大鼠，腹部正中剪開腹壁和肌肉，打開腹腔，上翻腸管及其他腎周臟器，暴露腎臟，無齒鑷分離腎周脂肪，血管鉗鉗夾腎蒂組織，眼科剪剪下雙側腎臟，迅速置于4 ℃ PBS溶液中。洗去血液，縱向剖開腎臟，放入4%多聚甲醛溶液中固定保存。

1.3 主要試劑和儀器

1.3.1 主要試劑：乙二醇、氯化氨(美國Alfa Aesar公司產品)；鈣鹽染色試劑盒，檸檬酸組織抗原修復液，濃縮型DAB試劑盒，磷酸鹽緩沖液粉劑，APES防脫片劑，快捷型酶標山羊抗鼠/兔IgG聚合物(即用型MaxivisonTM試劑)(福州邁新生物技術有限公司)；OPN小鼠抗大鼠單克隆抗，CD44兔抗大鼠多克隆抗體(上海越研生物科技有限公司美國RB公司進口分裝產品)。

1.3.2 主要儀器：切片機leica RM 2245，光學顯微鏡leica DMLP，自動脫水機Leica TP1050(德國萊卡公司)；電熱恒溫鼓風干燥機箱(60 ℃)，數(shù)顯電熱恒溫水溫箱 PC-1000(上海躍進醫(yī)療器械廠)；電熱恒溫電熱箱(45 ℃)；DHP-9052 TP1050(上海醫(yī)用恒溫設備廠)；病理圖像分析系統(tǒng)(北京Medex公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 HE染色，對腎小管管腔內的結石晶體的觀察：(1)切片，二甲苯II級透明、脫蠟各10 min，梯度酒精水化切片；(2)蘇木素染色5 min、鹽酸酒精分色5～10 s，自來水沖洗各5 min，伊紅染料復染3～5 min；(3)梯度酒精脫水，二甲苯II級透明；(4)中性樹膠封片。

1.4.2 鈣鹽染色，對腎小管上皮細胞基底膜和間質的鈣鹽沉積情況的觀察：(1)切片，二甲苯II級透明、脫蠟各10 min，梯度酒精水化切片；(2)滴加1滴(100 μL)硝酸銀于切片上，置于強光下作用30 min后，蒸餾水洗5 min；(3)滴入1滴(100 μL)硫代硫酸鈉處理2 min，蘇木素襯染1 min，流水沖洗各10 min；(4)伊紅染色1 min，95%酒精洗滌分化，無水酒精脫水、透明；(5)中性樹膠封片。

1.4.3 免疫組化，對OPN和CD44表達情況的檢測：采用快捷免疫組化MaxivisonTM染色法，分別檢測各組標本中OPN和CD44的表達情況，實驗嚴格按照說明書進行。用己知陽性組織切片做陽性對照，每個指標以PBS液代替一抗做陰性對照。

(1)切片：二甲苯II級透明、脫蠟各10 min，梯度酒精水化切片；(2)抗原熱修復：將切片置于已沸騰的檸檬酸組織抗原修復液的壓力鍋中，繼續(xù)加熱到噴汽后并持續(xù)90 s，自然冷卻至室溫后，用PBS沖洗3 min×3次；(3)每張玻片用3%H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗3 min×3次；(4)滴加適當比例稀釋的一抗，37 ℃孵育2 h，PBS沖洗，3 min×3次；(5)即用型MaxivisonTM試劑37 ℃孵育20 min，PBS沖洗，3 min×3次；(6)DAB染色，避光，隨時顯微鏡觀察，以細胞內出現(xiàn)棕黃色顆粒為顯色，自來水、蒸餾水各沖洗1次；(7)復染:在蘇木素染色45～60 s，自來水沖洗，酒精分化2～3 s，EDTA返藍；(8)梯度酒精脫水透明，二甲苯透明；(9)中性樹膠封片。

1.5 評價標準

1.5.1 腎小管管腔內的草酸鈣結石晶體的評分標準[5]：按照文獻對腎小管管腔內的草酸鈣結石晶體進行評分，見表1。

表1 光鏡下腎小管管腔內結石晶體的評分標準[5]

1.5.2 OPN和CD44的免疫組化結果判定

(1) OPN、CD44陽性結果判斷: OPN為胞質表達,腎小管上皮細胞質呈棕黃色至深棕黃色為陽性表達。CD44 為胞膜表達,腎小管上皮細胞膜呈線狀棕褐色為陽性表達。染色強度高于背景的非特異性染色判定為陽性。

(2)實驗指標: OPN、CD44陽性表達強度以灰度值作為衡量指標進行統(tǒng)計分析。

(3)圖像分析:使用Medex彩色病理圖像分析儀分析圖像。具體方法如下:先在低倍鏡下(× 100)篩選出表達較強的區(qū)域，然后在這些區(qū)域中隨機選取5個高倍視野(× 400)測灰度值，然后取平均值?；叶戎涤髣t陽性染色強度愈大。

1.6 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據經核實后，采用MATLAB2010b統(tǒng)計分析軟件。計量資料比較用方差分析，相關性分析采用Pearson和Spearman相關分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠腎小管管腔內結石晶體的評分結果

光鏡下對各組腎小管管腔內的結石晶體進行評分，評分結果見表2，14 d組的評分高于其他各組(P<0.05) 。

表2 各組腎小管管腔內的結石晶體評分

Tab 2 The grading of crystal stone of tubular lumen among rats of each group under light microscope

表2 各組腎小管管腔內的結石晶體評分

1)與其他各組相比，P<0.05

組別動物數(shù)量結石晶體評分對照組50.28±0.133 d組50.60±0.435 d組50.93±0.367 d組51.45±0.6214 d組5 3.85±0.931)21 d組52.11±0.5228 d組51.98±0.42

2.2 鈣鹽沉積情況

對照組、3、5 d組均未見明顯的鈣鹽沉積，而在7 d組出現(xiàn)了鈣鹽沉積，14 d明顯，主要表達于腎小管上皮細胞基底膜和間質中，見圖1。

圖1 14 d組 鈣鹽沉積 ×500

2.3 OPN在腎臟中的表達

與對照組相比，腎髓袢處的OPN，在3 d組基本無表達，在5 d組有少許表達，在7 d組表達開始明顯，在14 d組(圖2)明顯表達，在21 d組、 28 d組表達略下降,但仍明顯強于7 d組。其中，對照組、3 d組、5 d組、7 d組與14 d組比較，差異有顯著性意義 (P<0.05)。見表3。

圖2 14 d組OPN在髓袢處的明顯表達 ×500

2.4 CD44在腎臟中的表達

與對照組相比，腎髓袢處的CD44在3 d組基本沒有表達，在5 d組有少許表達，在7 d組弱表達，而在14 d組明顯表達(圖3) ，21 d組和28 d組高表達。見表4。

表3 各組OPN的表達(灰度)

Tab 3 Comparison of OPN expression among rats of each group(gray)

表3 各組OPN的表達(灰度)

1)與14 d組相比，P<0.01；2)與14 d組相比，P<0.05

組別動物數(shù)量灰度對照組58.95±1.361)3 d組514.68±3.281)5 d組520.82±4.702)7 d組525.52±5.962)14 d組535.73±9.3921 d組533.07±8.1728 d組528.04±7.51

圖3 14 d組 CD44在髓袢處明顯表達 ×500

表4 各組CD44的表達(灰度)

2.5 OPN與CD44的相關性

分別用Pearson相關系數(shù)和Spearman秩相關系數(shù)來分析OPN與CD44的相關性。利用MATLAB2010b軟件進行計算。OPN與CD44的Pearson相關系數(shù)為0.8908，Spearman秩相關系數(shù)為0.8571。二者總體的相關性不是太明顯。將數(shù)據分段，前14 d的數(shù)據作為一組，后面的數(shù)據作為一組進行分析。通過MATLAB軟件的計算，前14 d OPN與CD44的Pearson相關系數(shù)為0.9887，Spearman秩相關系數(shù)為1；14 d以后OPN與CD44的Pearson相關系數(shù)為-0.8191，Spearman秩相關系數(shù)為-1。前14 d OPN的灰度值隨著CD44灰度值的增加而增加；二者線性相關性很強，且呈正相關；14 d以后，隨著CD44灰度值的增加OPN的灰度值反而在減少，二者呈負相關。見圖4。

圖4 OPN與CD44的灰度值對比

3 討 論

骨橋蛋白(OPN)是一種帶負電的非膠原性骨基質磷酸化分泌性糖蛋白，廣泛存在于體液中，主要存在于骨組織，同時也參與了機體不同的病理生理反應，如炎癥反應，細胞存活，免疫應答以及腫瘤的發(fā)生[6-7]。而CD44 是OPN 的受體，存在于固有的腎小球巨噬細胞，腎小球囊壁層上皮細胞，髓質小管，偶爾存在于皮質小管(髓袢粗支升段和遠曲小管)中，在細胞與細胞之間及細胞與細胞外基質之間的信息傳遞過程中，在T細胞和單核細胞的激活、淋巴細胞與內皮細胞的粘附以及腫瘤細胞的增殖和轉移、促進創(chuàng)傷修復的纖維化等過程中，發(fā)揮重要作用。

Khan等[8]發(fā)現(xiàn)結石大鼠腎臟中的OPN表達增加。有研究者在猴腎小管上皮細胞中加入草酸鈣晶體，OPN的含量及其基因的表達均明顯增加。諸多發(fā)現(xiàn)使OPN與結石形成的關系成為學者們研究的焦點，人們通過高草尿酸大鼠模型來進行研究。

在實驗性草酸鈣腎結石研究中，人們常用乙二醇+氯化氨溶液作為誘石劑。這種方法屬于慢性成石，具有穩(wěn)定的成模性與良好的重復性，用于雄性大鼠幾乎100%形成草酸鈣結石[4]。根據文獻資料，乙二醇飲水的濃度控制在0.5%～1%比較合適。本實驗采用0.5%乙二醇+0.5%氯化氨方法進行。7～21 d后在偏振光顯微鏡下觀察到結石大多位于髓質處，與Randall斑常出現(xiàn)的部位相吻合，進一步驗證了結石形成的Randall斑學說。

本實驗發(fā)現(xiàn)，在實驗組，隨著時間的推移，與對照組相比，腎臟組織水腫變脆，腎臟重量相對增加明顯，病理圖片顯示腎小管上皮細胞水腫甚至變性。通過鈣鹽染色，在偏振光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，隨著時間的推移，大鼠腎髓袢中的鈣鹽沉積也逐漸增多，體積逐漸變大，7 d組的結石晶體明顯增加，14、21 d組達到最高。與此同時，OPN的表達也相應明顯。鈣鹽沉積明顯的腎臟，免疫組化顯示OPN表達也明顯增強，鈣鹽沉積少的腎臟，OPN表達也弱。OPN的變化隨著結石的變化而變化，說明OPN有可能參與了結石形成，但具體機制尚不能肯定。

有學者發(fā)現(xiàn)OPN可以抑制結石的形成。OPN基因缺失的大鼠，腎小管出現(xiàn)明顯的草酸鈣結石，而正常大鼠沒有結石形成[9-10]。以溶解狀態(tài)存在于尿液中的OPN，能抑制草酸鈣的粘附力[11]。也有學者發(fā)現(xiàn)OPN可以促進結石的形成。有研究發(fā)現(xiàn)加入OPN的MDCK細胞系粘附草酸鈣結晶的速度比不加的組別快1.4倍。而應用抗OPN單克隆抗體或轉染OPN的反義鏈cDNA基因可顯著減少草酸鈣晶體對細胞的粘附[12]。有人研究表明，草酸鈣粘附力和聚集力的增加能導致結晶種植到表面含有OPN的膠原蛋白顆粒上。因此，表面固化的OPN能增加草酸鈣的粘附力。本實驗中前14 d OPN表達逐漸增強，灰度值從3 d組的14.68±3.28，增強到14 d組的35.73±9.39；而對照組為8.95±1.36，這有可能是溶解狀態(tài)的OPN在抑制結石方面起作用。而實驗中14 d后OPN表達逐漸減弱，灰度值降至28 d組的28.04±7.51，這有可能是OPN固化并參與了基質構成，從而加速了晶體的粘附聚集，促進了結石的形成，因而表達減弱。

本研究發(fā)現(xiàn)，在某一時間段內，OPN與CD44同步表達。3 d組OPN與CD44均無明確表達，但5 d組OPN與CD44已有少許表達在髓質，OPN表達略強。14 d組OPN與CD44表達明顯增強。而在同一只實驗大鼠中，OPN強表達的大鼠，CD44也強表達，通過相關性分析，OPN與CD44呈正相關。這表明可能OPN首先出現(xiàn)在受損的腎小管部位，繼而與巨噬細胞表面的CD44受體結合，趨化巨噬細胞到達受損部位。由于在人一水草酸鈣腎結石中，薄層條紋的有機質中含有OPN，是腎結石的有機基質成分之一，所以有理由相信，OPN參與了結石的形成。

OPN受體包括兩類：integrin和CD44，是普遍存在的多結構、多功能的跨膜糖蛋白，介導細胞之間和細胞與基質之間的相互作用。近年研究認為，OPN是一種強大的巨噬細胞趨化因子和粘附因子。OPN經凝血酶酶切以后，其N-末端片段能夠與巨噬細胞表面的CD44受體結合，對巨噬細胞具有趨化功能；而其C-末端片段則可與細胞表面的integrin受體αvβ1相互作用，介導巨噬細胞的粘附和遷移[13]。在局部缺血和中毒性損傷后的修復過程中，CD44和OPN在再生小管中被表達。這些證據表明，OPN和它的受體CD44的相互作用，也許參與了腎臟損害后的炎癥和修復過程，能夠對結石的形成產生影響。所以，當OPN與CD44表達增強時，二者的結合會趨化巨噬細胞到達炎癥部位，通過巨噬細胞將結晶體吞噬、內化或轉運到其它地方，最終導致結石的形成[14]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，至14 d以后，OPN表達減弱，但CD44依然高表達，二者呈負相關。這表明巨噬細胞可能依然作用在受損部位。有學者研究對于野生型大鼠，注射OPN、OPN酶切片段或MPC-3會引起大量的巨噬細胞聚集在實驗部位；而對于CD44敲出鼠，注射OPN、OPN酶切片段卻沒有出現(xiàn)更多的巨噬細胞聚集，而注射MPC-3未對巨噬細胞聚集產生明顯影響[15]。這說明，除了OPN通過與CD44的結合趨化巨噬細胞參與炎癥反應外，還有其他的因子參與了對巨噬細胞的趨化作用。因此，當OPN 參與了結石形成而表達減弱時，由于有MPC-3等因子對巨噬細胞的趨化作用，所以巨噬細胞依然作用在受損部位，而位于巨噬細胞表面的CD44的表達依然比較明顯。

本研究結果提示，OPN和CD44表達與高草酸尿液狀態(tài)的結石形成關系密切，可能成為Randall斑的起源。

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