謝莉 何振華 譚小武

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是一種以肺間質(zhì)損害和纖維化為病理學(xué)特征的彌漫性肺間質(zhì)性疾病[1]。其病因不明，但危害嚴(yán)重，一般而言，本病確診后平均生存期約3～5年，5年生存率僅30%～50%[2-3]。近年研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及其抑制劑(TIMPs)在細(xì)胞外基質(zhì)的降解與重塑過程中發(fā)揮重要作用[4-5]。在本研究當(dāng)中，我們擬建立大鼠肺纖維化模型，探索匹伐他汀對博來霉素致大鼠肺纖維化中干MMP-9和TIMP-1表達(dá)的影響，以進(jìn)一步明確其抗纖維化作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

博來霉素為日本化藥株式會社產(chǎn)品（批號740104），匹伐他汀為廣東東陽光藥業(yè)有限公司產(chǎn)品(純度：95.6%，批號：0703001）。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司。MMP-9單克隆抗體購自Santa Cruz。TIMP-1多克隆抗體為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。HRP標(biāo)記羊抗鼠多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。堿性磷酸酶顯色劑購自普洛麥格。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與動物模型的建立

54只健康大鼠雄性SD大鼠隨機(jī)分為模型組、陰性對照組以及匹伐他汀組，各18只。將大鼠仰臥固定于操作臺上，經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉(2.5mL/kg)后，頸部消毒，分離暴露氣管，注射器經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙朝向心端刺入氣管并緩慢注入0.3mL博萊霉素生理鹽水溶液(5mg/kg)或生理鹽水溶液，注后立即將動物直立并左右旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)均勻分布。對照組注入等體積的生理鹽水。

1.3 標(biāo)本的采集與處理

在造模2、4、6周進(jìn)行取材（腹腔動脈放血法處死實(shí)驗(yàn)大鼠），每次各組隨機(jī)處死6只。取右肺組織切成小塊存于無菌EP管中，同時(shí)獲取肺泡灌洗液（BALF）置于-80℃凍存以用于下一步研究。

1.4 Western blot檢測MMP-9和TIMP-1的表達(dá)

按試劑盒說明提取上述肺組織蛋白并進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)束后按照半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂牛奶的TBS溶液室溫封閉2h，PBST洗滌后與抗HO-1抗體于4℃孵育過夜。最后與HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗室溫孵育2h。暗室發(fā)光顯影，灰度掃描。

1.5 ELISA檢測肺泡灌洗液中MMP-9以及TIMP-1的產(chǎn)生

獲取肺泡灌洗液，并按照試劑盒說明書提前15min配制好工作液。操作步驟按照試劑盒提供的方法進(jìn)行。包括繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，加入樣品，洗滌，顯色等步驟。最后于波長450nm下用酶標(biāo)儀測定其OD值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肺泡灌洗液中MMP-9，TIMP-1濃度

肺泡灌洗液中MMP-9，TIMP-1濃度見表1所示。在模型組中，MMP-9濃度在第2周水平最高，隨后開始下降，但第6周水平依然高于陰性對照組。匹伐他汀處理后，MMP-9濃度均低于同期模型組，但同樣也高于對照組。TIMP-1的產(chǎn)生情況與MMP-9類似。見表2。

表1 各研究組大鼠BALF中MMP-9濃度（ng/ml）

表2 各研究組大鼠BALF中TIMP-1濃度（ng/ml）

2.2 MMP-9和TIMP-1蛋白表達(dá)情況

與對照組相比，博萊霉素模型組在第2周時(shí)MMP-9和TIMP-1蛋白表達(dá)明顯增高。4周后，MMP-9表達(dá)水平有所減少，但TIMP-1依然呈高水平表達(dá)，直到第6周才略有降低。匹伐他汀處理組MMP-9和TIMP-1均低于模型組水平。見圖1，圖2。

圖1 各組MMP-9表達(dá)情況 圖2 各組TIMP-1表達(dá)情況

3 討論

肺纖維化的發(fā)生是一個非常復(fù)雜的病理生理過程，盡管病因各異，但肺組織中的基質(zhì)代謝異常是本病中的共同特征，在此過程中，MMPs及其抑制劑TIMPs在細(xì)胞外基質(zhì)的講解與重塑過程中發(fā)揮至關(guān)重要作用[5]。任何能引起其合成和降解異常的因素都可以引起細(xì)胞外基質(zhì)聚集，最終導(dǎo)致肺纖維化的形成。博萊霉素是用于建立纖維化模型的理想藥物。在早期誘導(dǎo)的纖維化過程中，由于博萊霉素所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)促進(jìn)免疫細(xì)胞合成和釋放一系列炎癥細(xì)胞因子，從而引起MMPs的合成與活化。因此這時(shí)期尚未出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)堆積。在繼發(fā)性修復(fù)階段，MMPs的活性有所降低，而TIMP-1表達(dá)仍維持在較高水平，引發(fā)了MMP-9/TIMP-1的比例失衡，從而引起纖維化的發(fā)生[6-7]。我們的研究結(jié)果也顯示，模型組在2～6周內(nèi)，隨著時(shí)間延長，MMP-9含量逐漸降低，而6w時(shí)TIMP-1依然表達(dá)持續(xù)升高，與上述理論相符。

匹伐他汀是第一個全合成的HMG-CoA還原酶抑制劑，是一類降脂藥物[8]。近年的研究顯示，他汀類藥物能可通過抑制MMPs活性、抑制成纖維細(xì)胞增殖以及膠原合成、調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，因此可能具有抗纖維化的作用[9]。但直接進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)并觀察其抗肺纖維化方面的研究并不多。在本研究當(dāng)中，我們通過動態(tài)觀察結(jié)果顯示，匹伐他汀處理后，博萊霉素所致的肺纖維化在2周、4周和6周時(shí)，匹伐他汀均表現(xiàn)出明顯的降低MMP-9及TIMP-1的作用，尤其以第4周（肺纖維化形成期）MMP-9的降低作用尤為明顯。這可能是匹伐他汀減輕基底膜損傷、減輕肺泡炎性滲出的重要機(jī)制。6周后，肺內(nèi)主要病理生理改變?yōu)榉卫w維化，而匹伐他汀在此時(shí)期依然能降低MMP-9的水平，同時(shí)也能降低TIMP-1的表達(dá)水平，使MMPs/TIMPs趨于平衡，最終延緩/抑制纖維化的發(fā)生發(fā)展。綜上所述，匹伐他汀能降低肺纖維化大鼠模型中MMP-9和TIMP-1水平，因此有望成為治療本病的輔助用藥。

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[5]Dancer RC, Wood AM, Thickett DR. Metalloproteinases in idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Eur Respir J, 2011.

[6]Patel RB, Kotha SR, Sherwani SI, et al. Pulmonary fibrosis inducer, bleomycin, causes redox-sensitive activation of phospholipase D and cytotoxicity through formation of bioactive lipid signal mediator,phosphatidic acid, in lung microvascular endothelial cells[J]. Int J Toxicol,2011,30(1):69-90.

[7]Degryse AL, Lawson WE. Progress toward improving animal models for idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Am J Med Sci, 2011,341(6):444-449.

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[9]Kim JW, Rhee CK, Kim TJ, et al. Effect of pravastatin on bleomycin-induced acute lung injury and pulmonary fibrosis[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2010,37(11):1055-1063.