郭月超，王恩波，趙群，吉士俊，張立軍

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院小兒骨科，沈陽 110004）

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過墨汁灌注方法對(duì)組織血運(yùn)的觀察是一種操作簡(jiǎn)單、成本低廉、效果明顯的方法。目前廣泛應(yīng)用于動(dòng)物腦組織、內(nèi)臟及眼底的微循環(huán)灌注［1，2］。現(xiàn)將墨汁灌注的方法應(yīng)用于兔股骨頭，觀察兔股骨頭灌注效果，經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，

取得良好的效果。

1 材料與方法

1.1材料

動(dòng)物：日本大耳白兔10只，6周齡，體質(zhì)量0.8~1.0 kg。由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供。印度墨汁原液：印度墨汁由上海寶曼華藍(lán)公司提供。

1.2方法

1.2.1 明膠墨汁的配制：分別將3、5、10 g明膠溶于100 mL蒸餾水中，制成3%、5%、10%明膠溶液，于60℃溫箱中1 h后完全溶解。室溫下觀察，3%明膠溶液呈膠凍狀，較軟，震動(dòng)時(shí)易碎；10%明膠溶液呈固態(tài)，劇烈震動(dòng)下形態(tài)穩(wěn)定；5%明膠溶液介于兩者之間。將1 mL印度墨汁原液分別溶于1 mL、2 mL、3 mL、4 mL蒸餾水中稀釋，用棉簽蘸少許墨汁涂于白紙上對(duì)比觀察。印度墨汁原液涂色均勻一致；1∶1稀釋液稍有不均勻；1∶2稀釋液深淺不均勻明顯；1∶3稀釋液可見灰色涂色區(qū)有少量黑色痕跡。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)，配制明膠墨汁的比例為10 g明膠∶50 mL印度墨汁∶50 mL蒸餾水，配制成10%明膠墨汁，于60℃溫箱中備用。

1.2.2 固定液及沖洗液的配制：固定液采用4%多聚甲醛，于60℃溫箱中過夜備用。沖洗液采用12 500 U肝素溶于500 mL生理鹽水中，放入37℃溫箱中備用。

1.2.3 明膠墨汁灌注方法和步驟：（1）麻醉：5%水合氯醛4 mL/kg腹腔注射，麻醉成功后將兔仰臥位固定，下肢固定時(shí)使用膠帶固定，勿用繃帶直接系住下肢，以免影響血運(yùn)。（2）插管：沿腹中線開口，充分暴露腹主動(dòng)脈及下腔靜脈。將腹主動(dòng)脈和下腔靜脈各游離1~2 cm，結(jié)扎近心端，向腹主動(dòng)脈遠(yuǎn)心端插入套管針，絲線固定，作為灌注口。下腔靜脈結(jié)扎遠(yuǎn)端剪開一5 mm小口，作為引流口。（3）灌注：將37℃肝素生理鹽水從灌注口注入兔腹主動(dòng)脈內(nèi)沖洗血管，直至引流口流出清亮液體為止。將60℃4%多聚甲醛從灌注口注入，當(dāng)兔出現(xiàn)全身痙攣時(shí)即可停止。再將60℃10%明膠墨汁在90 mmHg［1］壓力按20 mL/kg從灌注口注入，見兔雙下肢皮膚及爪尖變黑，引流口亦有墨汁流出。灌注結(jié)束后立即結(jié)扎腹主動(dòng)脈及下腔靜脈遠(yuǎn)心端，防止墨汁再流出。關(guān)腹，立即放入-20℃冰箱中冷凍6 h。

1.2.4 取材及切片：將冷凍好的兔股骨頭及髖臼一同取下，放入4%多聚甲醛固定5 d。固定后放入20%甲酸中脫鈣2周，蒸餾水沖洗24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。行冠狀面切片，片厚分別為5μm、10μm、20μm、40μm。常規(guī)脫蠟，HE染色，脫水，封片。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察：灌注墨汁時(shí)兔皮膚毛細(xì)血管網(wǎng)清晰可見成黑色（圖1）。髖關(guān)節(jié)冠狀面可見股骨頭骨骺、股骨近端、大轉(zhuǎn)子、髖臼及關(guān)節(jié)囊被染成黑色，股骨頭軟骨及生長(zhǎng)板顏色變深（圖 2）。

2.2 光鏡觀察：見10只兔股骨頭病理片中均清楚顯示股骨頭骨骺?jī)?nèi)黑色墨汁。切片越厚墨汁越清晰，但組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞層次越模糊。對(duì)比以上各厚度病理片，厚度為10μm較合適，既能在低倍鏡下清楚看清黑色墨汁，又能清楚顯示細(xì)胞層次（圖3）。而且黑色墨汁和組織分界清楚，墨汁并不會(huì)影響骨骺軟骨和生長(zhǎng)板結(jié)構(gòu)的觀察。

3 討論

觀察股骨頭血運(yùn)的方法臨床上多采用DSA、ECT或MRI等方法。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中上述方法因成本高、動(dòng)物股骨頭小等因素受到限制。墨汁灌注已經(jīng)廣泛已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物組織灌注［2~4］。明膠是一種水溶性蛋白質(zhì)混合物，可溶于35~40℃水，增加水的粘度和穩(wěn)定性。根據(jù)明膠與水的比例不同，常溫下可成膠凍狀或固態(tài)。印度墨較顆粒細(xì)小，并且含有組織膠成分，可以牢固的對(duì)組織進(jìn)行染色，不會(huì)在沖洗過程中被洗掉。事實(shí)證明，在標(biāo)本脫鈣、沖洗、浸蠟及烤片過程中，脫鈣液及蒸餾水保持清亮透明，無墨汁脫落現(xiàn)象。

圖1 灌注墨汁（綠箭頭：血管變黑）

圖2 股骨頭冠狀面

圖3 HEX20股骨頭骨骺?jī)?nèi)黑色墨汁

我們將墨汁灌注的方法應(yīng)用于股骨頭血運(yùn)的觀察，在反復(fù)實(shí)驗(yàn)中得到以下體會(huì)：（1）60℃多聚甲醛可以使血管在擴(kuò)張狀態(tài)下對(duì)組織和血管進(jìn)行良好的固定，防止細(xì)胞溶解；（2）10%明膠墨汁在室溫下呈膠凍狀，不會(huì)透過血管壁或細(xì)胞壁影響其他組織的觀察；（3）從腹主動(dòng)脈灌注，下腔靜脈引流使灌注過程不經(jīng)過心臟，保證動(dòng)物處于存活狀態(tài)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，避免了因動(dòng)物死亡造成的體溫下降、血管痙攣等影響因素；（4）軟組織的墨汁灌注在切片時(shí)需要切50~100μm甚至更厚的病理片才能清楚看到整根血管。股骨頭的墨汁灌注，因骨骺中為血竇成分，不存在整根血管，故切片時(shí)只需切10μm既能清楚顯示黑色墨汁，又能清楚分清細(xì)胞層次。（5）以往的文獻(xiàn)報(bào)道中認(rèn)為墨汁灌注時(shí)盡量充分灌注，才能使血管顯示完全，易于觀察［2，5］。我們認(rèn)為，股骨頭血運(yùn)特殊，骨骺?jī)?nèi)為血竇，相互通連，故不應(yīng)過度灌注墨汁，應(yīng)處于灌注不飽和狀態(tài)，才能正確比較股骨頭血運(yùn)受阻時(shí)墨汁灌注量的變化。但應(yīng)注意灌注時(shí)壓力應(yīng)接近動(dòng)物平均動(dòng)脈壓，壓力過高會(huì)造成灌注過度；灌注量應(yīng)與動(dòng)物體質(zhì)量成相同的比例，對(duì)于兔而言20 ml/kg接近飽和狀態(tài)。（6）股骨頭骨骺?jī)?nèi)無法進(jìn)行血管

數(shù)量統(tǒng)計(jì)，但可以通過測(cè)量面積表示血運(yùn)情況，進(jìn)行定量分析。即在10μm薄片中通過圖像分析軟件測(cè)量出骨骺?jī)?nèi)黑色墨汁面積和股骨頭骨骺面積，兩個(gè)面積的比值為灌注量，這樣可以避免單純計(jì)算面積時(shí)兔股骨頭發(fā)育大小的影像，在顯微觀察下為股骨頭血運(yùn)的定量分析提供了科學(xué)可靠的方法。

［1］赫光榮.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)［M］.上海：第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，2005：263.

［2］李郎，孫俊，李明，等.加溫灌注明膠墨汁制作動(dòng)物腦血管模型的方法［J］.中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志，2004，22（2）：224.

［3］童建斌，曾樂平，陳旦，等.明膠墨汁灌注展示大鼠視網(wǎng)膜血管的方法［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，29（21）：2031-2033.

［4］Taguchi Y，Takashima S，SasaharaE，et al.Morphological changes in capillariesin theischemic brain in Wistar rats［J］.Arch Histol Cytol，2004，67（3）：253-261.

［5］胡志明，王海彬，周明乾，等.激素性股骨頭壞死股骨頭微血管的變化［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，26（6）：785-787.