白云峰，田菊，權(quán)文香，，前田潔

（1.解放軍第302醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病診療與研究中心一科，北京 100039；2.北京大學第六醫(yī)院生化室，北京 100191； 3.日本神戶大學醫(yī)學系研究科精神神經(jīng)科，日本 神戶 6500017）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’sdisease，AD）是一種漸進性神經(jīng)變性疾病，分為家族性AD（FAD）和散發(fā)性AD（SAD）兩種類型，其中SAD占多數(shù)。在歐洲SAD的比例為50%~75%，在日本SAD占80%~90%。目前為止有3種AD的致病基因：β淀粉樣蛋白前體（APP）、早老素 1（presenilin-1，PSEN1）和早老素 2（PSEN2）。FAD 大多與 PSEN1、APP 基因突變有關(guān)，極少數(shù)與PSEN2基因突變有關(guān)。迄今為止，世界范圍內(nèi)共發(fā)現(xiàn)與FAD相關(guān)的PSEN1基因突變有164個，與SAD相關(guān)的PSEN1基因突變有3個。與PSEN1基因同源性的PSEN2基因中也有11種基因突變的報道，10種基因突變與FAD相關(guān)，1種基因突變與SAD相關(guān)。ApoE是SAD和晚發(fā)性FAD的易感基因，ApoE等位基因ε4是SAD的主要遺傳風險因子［1］，然而攜帶APOEε4的SAD患者并不一定發(fā)病，所以可能還存在其他遺傳風險因子。我們?yōu)榱诉M一步探討SAD與PSEN2基因突變的相關(guān)性，進行了日本人群中PSEN2基因的序列測序。

1 材料與方法

1.1 材料來源

300例患者來自日本神戶大學附屬醫(yī)院精神神經(jīng)科門診。其中男120例，女180例，年齡56~92歲，平均（72.57±7.56）歲。入組患者均進行常規(guī)檢查、腦電圖、MRI檢查，MRI檢查顯示內(nèi)顳葉結(jié)構(gòu)萎縮，包括海馬結(jié)構(gòu)、杏仁核和內(nèi)嗅皮質(zhì)［2，3］。并根據(jù)NINCDS/ADRDA統(tǒng)一標準確立為很可能的AD［4］，患者或知情者訴有超過6個月的緩慢進行性記憶減退，測試發(fā)現(xiàn)有嚴重的情景記憶損害的客觀證據(jù)，主要為回憶受損，通過暗示或再認測試不能顯著改善或恢復(fù)正常，全部患者無陽性家族史。并用簡易智能量表（MMSE）進行認知能力評估，評分≤24分者被選入組。對照組300例來自社區(qū)隨機抽樣。其中男120例，女180例，年齡55~94歲，平均（70.97±6.73）歲；進行神經(jīng)系統(tǒng)檢查及MRI檢查均正常者被選入組，并且MMSE得分≥28分。此研究經(jīng)日本神戶大學醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及PCR：提取所有受試者的周圍血5 ml，用基因組DNA提取試劑盒從外周血的白細胞中提取基因組DNA。用PCR方法進行PSEN2基因外顯子區(qū)域的擴增。正向引物及反向引物見表1。用Takara DNA多聚酶進行PCR。反應(yīng)體系30μL：包括100ng基因組DNA 1μL、30pmol/L的引物各1μL、3μL的 10×PCR 緩沖液、0.2 mmol/L的dNTP 3μL、1U的Takara Taq DNA多聚酶0.15μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃變性9 min后，進入主循環(huán)；95℃30 s、各外顯子PCR的不同退火溫度30 s、72℃1 min共35個循環(huán)后72℃延伸10 min。外顯子2的PCR退火溫度為65℃，外顯子4的PCR退火溫度為56℃，其他外顯子PCR的退火溫度為60℃。取PCR產(chǎn)物5μL在2%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，之后用EB染色并在紫外線下觀察結(jié)果。

1.2.2 堿基序列測序：采取直接測序PCR產(chǎn)物，首先用PCR純化試劑盒（Qiagen，USA）純化25μL的PCR產(chǎn)物，然后進行堿基序列的測序反應(yīng)（用PCR引物），反應(yīng)體系為20μL；包括純化PCR產(chǎn)物1 μL，10 pmol/L的單向引物2μL，BigDye Terminator1.1的4μL，Sequence緩沖液4μL。退火溫度為56℃。然后用ABI 3700基因測序儀（ABI，USA）進行測序。核酸序列經(jīng)數(shù)據(jù)收集軟件整理，用DNAsis2軟件進行序列對比分析。

2 結(jié)果

采用12對引物（表1），對PSEN2基因的各外顯子分別進行PCR及直接測序。測序300例患者組PSEN2基因序列，在3例SAD患者的外顯子3上發(fā)現(xiàn)了100G>A基因突變，第34號密碼子由甘氨酸到絲氨酸（G34S）的變化（圖1），而300例對照組中沒有發(fā)現(xiàn)此基因突變。顯然，100G>A基因突變在SAD組中的頻率為1%，對照組中的頻率為0%。此外，在1例67歲的SAD患者PSEN2基因的外顯子4上發(fā)現(xiàn)1915C>T基因突變，但此基因突變沒有引起氨基酸編碼的改變（87H）。

表1 各外顯子的引物Tab.1 The primers of exons

3 討論

圖1 PSEN2基因DNA測序結(jié)果Fig.1 The results of DNA sequencing of PSEN2

PSEN2基因全長24 837 bp，位于1號染色體，有12個外顯子，從第3個外顯子到第12個外顯子含有編碼區(qū)，共2 236 bp。PSEN2蛋白是由PSEN2基因編碼的448個氨基酸組成，是8次跨膜的膜蛋白質(zhì)。PSEN2蛋白與其同源性的PSEN1蛋白是γ分泌酶復(fù)合體的組成之一，也是活性中心。PSEN屬于天冬酰氨蛋白酶家族（aspartyl protease family），在8個跨膜結(jié)構(gòu)域（transmenbrane domain，TMD）中，2個分別位于TMD6及TMD7中的天冬氨酸殘基是催化剪切底物必需的活性位點（圖2）。PSEN首先以無活性的全蛋白形式分泌，再經(jīng)過自身催化的跨膜剪切斷裂為功能性片斷C端片段（CTF）和N端片段（NTF），才形成有生物功能的PSEN-NTF/CTF二聚體。除此之外，PSEN在C端保守的PAL（prolinealanine-leucine，脯氨酸-丙氨酸-亮氨酸）序列以及在第 4跨膜區(qū)中保守的 WNF（tryptophan-asparagine-phenylalanine，色氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸）序列，對于γ分泌酶的活性也很重要［5］。當PSEN蛋白異常時，會改變γ分泌酶的活性，從而導(dǎo)致中樞神經(jīng)細胞內(nèi)外產(chǎn)生過量的異常沉積的Aβ42，或?qū)е?Aβ42/Aβ40 的比例失調(diào)［6］。目前PSEN2基因測序的研究中，已發(fā)現(xiàn)11個PSEN2基因突變，所有基因突變的表現(xiàn)型均為AD。

為了探索AD的致病基因，以微陣列或SNP（singlenucleotidepolymorphism）為標記檢測堿基全序列的研究是目前國內(nèi)外的熱門。根據(jù)國際人類基因組計劃已經(jīng)清楚人類的全部基因，并進行了大量的基因分析，盡管這樣還有很多堿基替換的報道接連不斷。1995年，Sherrington等［7］發(fā)現(xiàn) M146L、H163R、A246E、L286V和C410Y 5個位于PSEN1基因的突變。相繼100多個PSEN1基因突變在家族性AD中陸續(xù)被報道，其中3個PSEN1基因突變是在SAD中被報道。其一是Dumanchin等［8］在法國的37歲SAD患者中發(fā)現(xiàn)的M139K基因突變。其二是Kamimura等［9］在日本的散發(fā)人群中發(fā)現(xiàn)的1例具有H163R基因突變的AD患者。這兩個基因突變分別位于PSEN1蛋白CTF第5外顯子的TM-II和第6外顯子的HL-II，認為均具有致病性［10］。其三是Scacchi等［11］在85歲SAD患者的外顯子4上發(fā)現(xiàn)的N32（AAT>AAC）的基因突變。該基因突變位于PSEN1蛋白的非功能區(qū)NTF，認為不具有致病性。另外，Rogaeva等［12］在家族性AD中發(fā)現(xiàn)了R35Q、A79V基因突變。這兩種基因突變也位于PSEN1蛋白的非功能區(qū)NTF，認為與AD發(fā)病無關(guān)。

PSEN2基因分析中，Bird首次提出PSEN2基因突變會引起家族性AD。Bird報道的Volga German家系的發(fā)病原因為N141I的基因突變，其AD的平均發(fā)病年齡為58.7歲［13］。同期，Rogaev等在意大利FLO10家系中發(fā)現(xiàn)了具有PSEN2基因M239V基因突變的9例患者，發(fā)病年齡為45~88歲，平均50歲。可見PSEN2基因點突變有早發(fā)性AD也有晚發(fā)性AD，且外顯率不是100%，同一家族里具有PSEN2基因點突變的成員不一定發(fā)病。PSEN2基因突變在SAD人群中也有報道，Cruts等在荷蘭的SAD人群中發(fā)現(xiàn)了R62H基因突變，位于PSEN2蛋白的非功能區(qū)NTF，患者的發(fā)病年齡為62歲，在SAD中此基因突變的頻率為1%，正常對照組中的頻率為0%。Walker等［14］將PSEN2基因突變載體轉(zhuǎn)染到神經(jīng)細胞內(nèi)，觀察Aβ的含量。發(fā)現(xiàn)N141I、M239V、M239I和T122P等基因突變體的Aβ42或者Aβ42/Aβ40的比例比對照組有明顯增多，但R62H、S130L、V148I、D439A 等基因突變體沒有相應(yīng)的變化?？梢姴糠諴SEN2基因突變可能是與AD發(fā)病無關(guān)的點突變。本文的G34S基因突變與R62H同樣在SAD中被發(fā)現(xiàn)，同樣位于PSEN2蛋白的非功能區(qū)NTF，G34S基因突變在SAD中的頻率為1%，在對照組中頻率為0%，曾被認為有可能與AD的發(fā)病有關(guān)［15］。G34S基因突變可能與SAD發(fā)病無關(guān)的正常多態(tài)性，但其生物學功能有待于進一步探討。對于1915 C>T（87H）的基因突變沒有引起氨基酸編碼的改變，且同樣位于PSEN2蛋白非功能區(qū)NTF，所以不會影響PSEN2蛋白的功能。

今后為了更多的發(fā)掘與AD相關(guān)的新的基因或者新的基因突變，有必要繼續(xù)進行基因分析。在AD發(fā)病中除了顯性遺傳之外，還有多個基因的多重作用，并且在明確的家系中也存在非顯性遺傳方式遺傳、或者母性遺傳方式遺傳的報道。更不應(yīng)忽視人種差異、區(qū)域、環(huán)境、放射線等基因以外的影響。AD遺傳學不像單一的顯性遺傳那么簡單，應(yīng)該是復(fù)合因子相互影響的一個復(fù)雜的問題。

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