張治業(yè)

(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南洛陽(yáng) 471003)

松茸屬擔(dān)子菌亞門(mén)、層菌屬、傘菌目、口蘑科、口蘑屬，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。松茸含有多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽、萜類(lèi)以及多種酶，國(guó)內(nèi)外對(duì)其多糖雖有報(bào)道[1～3]，但缺乏系統(tǒng)分析研究。2010年 10～12月，我們提取松茸多糖組分，并檢測(cè)其對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U87)、人宮頸癌(He-La)、人胰腺導(dǎo)管上皮癌(PANC-1)以及人乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7)的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料 二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó) Forma公司)，Thermo Multiskan MK3酶標(biāo)儀(美國(guó) Thermo公司)，5417R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf公司)，F(xiàn)-4500紫外分光光度計(jì)(日本 Hitachi公司)，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó) Becton Dickinson公司)，CKX41倒置顯微鏡(日本 Olympus公司)，2720型 PCR儀 (美國(guó) Applied Biosystems公司)，Tannon水平及垂直電泳槽(上海天能科技有限公司)，Tanon 3500凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自 Thermo公司，RPMI-1640培養(yǎng)基 (美國(guó) Gibco公司 )，胎牛血清 (FBS，杭州四季青公司)。U87以及 MCF-7細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純等。Trizol試劑(美國(guó) Invitrogen公司)，MMMV逆轉(zhuǎn)錄酶和 Ex Taq酶(日本 TaKaRa公司)，p53、18SRNA引物(上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成)，二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶 (PI)和RNase以及其他常用生物試劑購(gòu)自 Sigma公司(Sigma，USA)。松茸多糖由本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)文獻(xiàn)[4]自松茸中提取，松茸多糖用培養(yǎng)基配成 200μg/ml的儲(chǔ)存液，使用前用培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U87、PANC-1、MCF-7細(xì)胞用含10%FBS的 DMEM培養(yǎng)，HeLa細(xì)胞用含 10%FBS的 RPMI-1640培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于 96孔微量培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng) 24 h待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的松茸多糖，每個(gè)濃度設(shè) 3個(gè)復(fù)孔(邊緣孔不加樣品，以避免“邊緣效應(yīng)”)，并設(shè)相應(yīng)濃度的溶媒(即不加樣品，僅加相應(yīng)體積的樣品溶解液)對(duì)照及無(wú)細(xì)胞調(diào)零孔。藥物與細(xì)胞在 37℃、5%CO2條件下共孵育 48 h后加入 MTT，置培養(yǎng)箱中反應(yīng) 4 h，棄去孔中培養(yǎng)基和 MTT后加入 150 μl/孔的 DMSO，震蕩溶解生成的紫色結(jié)晶后立即用酶標(biāo)儀在 570 nm和 630 nm波長(zhǎng)處檢測(cè) 96孔平板中每孔細(xì)胞的光密度值(OD值)，測(cè)定波長(zhǎng)為 570 nm，校正波長(zhǎng)為 630 nm，所得值再減去空白的吸光度。按照公式(1-OD處理組/OD對(duì)照組)×100%計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期 細(xì)胞經(jīng)松茸多糖處理一定時(shí)間后，胰酶消化收集細(xì)胞，4℃固定在預(yù)冷的 70%乙醇中。檢測(cè)前離心棄去固定液，用PBS洗 2遍后，將細(xì)胞重懸在含 50 mg/L RNase和50 mg/L PI的 PBS中 ，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為 1×106個(gè) /ml，室溫置暗處染色 30 min，300目尼龍膜過(guò)濾后用流式細(xì)胞儀檢測(cè) DNA含量，采用 ModiFit軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.2.4 半定量 RT-PCR分析 細(xì)胞經(jīng)松茸多糖處理一定時(shí)間后，用 Trizol試劑依照說(shuō)明提取總 RNA，取 1μg RNA用 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物合成cDNA。采用 p53引物進(jìn)行 PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因。PCR反應(yīng)條件為 95℃變性 50 s，56℃退火 50 s，72℃延伸 55 s，p53為 30個(gè)循環(huán)，18S RNA為 25個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，用計(jì)算機(jī)圖像掃描分析系統(tǒng)測(cè)定電泳條帶光密度值，p53表達(dá)水平以該條帶密度與 18SRNA的百分比(%)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，數(shù)據(jù)以±s表示 ，組間比較采用 t檢驗(yàn) 。 P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 松茸多糖對(duì) U87、HeLa、PANC-1以及 MCF-7細(xì)胞影響 不同濃度的松茸多糖(高、中、低劑量組)均能夠抑制 4種細(xì)胞，抑制率隨著濃度增大而增大。見(jiàn)表1。

表1 松茸多糖對(duì) U87、HeLa、PANC-1、MCF-7細(xì)胞活性的影響

2.2 松茸多糖對(duì) U87、HeLa、PANC-1以及 MCF-7細(xì)胞周期的影響 U87經(jīng) 24.04μg/ml、HeLa經(jīng)19.6 μg/ml、PANC-1經(jīng) 21.3 μg/ml以及 MCF-7經(jīng)18.9μg/ml松茸多糖處理 48 h后，細(xì)胞周期發(fā)生明顯的變化，G1、G2期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增多。與空白對(duì)照組相比，松茸多糖處理后，4種細(xì)胞 S期細(xì)胞分別增多了 11.37%、8.48%、9.36%和 11.11%。表明松茸多糖處理可使 U87、HeLa、PANC-1以及MCF-7細(xì)胞阻滯于 S期。

2.3 松茸多糖對(duì) U87、HeLa、PANC-1以及 MCF-7細(xì)胞p53 mRNA表達(dá)的影響 U87經(jīng) 24.04μg/ml、HeLa經(jīng)19.6 μg/ml、PANC-1經(jīng) 21.3 μg/ml以及 MCF-7細(xì)胞經(jīng)18.9μg/ml松茸多糖處理 48 h后，p53 mRNA的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖1。顯示松茸多糖能夠上調(diào) p53 mRNA表達(dá)水平，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。

圖1 松茸多糖對(duì) U87、HeLa、PANC-1以及MCF-7細(xì)胞 p53m RNA表達(dá)的影響

3 討論

松茸富含粗蛋白、粗脂肪、粗纖維和維生素 B1、B2、維生素 PP等元素[5]，不但味道鮮美，而且還具有益腸胃、理氣化痰、驅(qū)蟲(chóng)及對(duì)糖尿病有獨(dú)特療效等功能，是中老年人理想的保健食品[6]。松茸多糖為從松茸中提取的大分子多糖類(lèi)物質(zhì)，具有抗腫瘤、保肝和免疫佐劑以及對(duì)環(huán)磷酰胺誘發(fā)損傷的拮抗作用和抗炎活性[7，8]。

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯是抗腫瘤作用的主要機(jī)制之一。已有研究表明，許多參與調(diào)控細(xì)胞周期的蛋白和基因都與細(xì)胞周期阻滯密切相關(guān)，如腫瘤抑制基因 p53。目前為止，p53基因是研究最透徹、功能最強(qiáng)大的一種抑癌基因，其作為一種轉(zhuǎn)錄因子能促進(jìn)或抑制很多與細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。當(dāng) DNA受到損傷時(shí)，p53蛋白表達(dá)產(chǎn)物急劇增加，可抑制細(xì)胞周期進(jìn)一步運(yùn)轉(zhuǎn)。一旦 p53基因發(fā)生突變，p53蛋白失活，細(xì)胞分裂失去節(jié)制，則會(huì)發(fā)生癌變。人類(lèi)癌癥中約有一半是由于 p53基因發(fā)生突變失活引起。

本研究顯示，松茸多糖能夠誘導(dǎo) U87、HeLa、PANC-1以及 MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)以及細(xì)胞周期的 S期阻滯。其機(jī)制可能是松茸多糖通過(guò)上調(diào) p53基因誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

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[4]王輝，劉剛，周本宏，等.松茸多糖對(duì) K562細(xì)胞的抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)藥師，2007，10(12):1180-1181.

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