朱明古，郭 文*，袁海鋒

(1南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院、廣東省胃腸疾病重點實驗室，廣州 510515;2菏澤市立醫(yī)院)

目前，對于晚期轉移或不可切除結腸癌患者的化療以及術后輔助性化療仍以 5-FU為主，但其總有效率仍不盡人意。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，芥菜籽及其活性提取物具有抗癌防癌活性[1～3]。因此，我們用芥菜籽提取物(MSE)直接作用于體外培養(yǎng)的人結腸癌細胞 SW480，以探討其對 SW480細胞體外增殖及凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人大腸癌 SW480細胞株由本實驗室傳代培養(yǎng)。芥菜籽購自湖北圣峰藥業(yè)有限公司。二甲亞砜 (DMSO)、RPMI1640和青、鏈霉素 (青霉素1 000 U/ml，鏈霉素 1 000 U/ml)、細胞計數(shù)測定試劑盒(CCK-8 kit)及 Caspase-3檢測試劑盒均為碧云天公司產(chǎn)品，胎牛血清(FBS)為杭州四季青產(chǎn)品;Hoechest33258染色試劑盒購自南京凱基生物公司。AnnexinV-PE/7AAD細胞凋亡測定試劑盒購自 Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 MSE的配制 10 mg/ml的 MSE貯存液以DMSO溶解配制而成，過 0.22μm微孔濾膜，置 4℃保存。用前恢復室溫，以 10%FBSRPMI1640培養(yǎng)液稀釋成相應濃度的工作液[4]。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和處理 人結腸癌 SW480細胞以含 10%FBS、100 U/ml青霉素、5%CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以含不同濃度 MSE的 10%FBS RP-MI1640鏈霉素為培養(yǎng)液(pH 7.4)，置 37℃培養(yǎng)不同時間后進行實驗分析。

1.2.3 細胞生長抑制實驗 取生長良好的人結腸癌 SW480細胞，配成單細胞懸液，稀釋成 100×106/L;加至 96孔板 ，每孔 100 μl，在 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng) 24 h，棄去原培養(yǎng)液，加入不同濃度 MSE的 10%FBS RPMI1640培養(yǎng)液，設置成 0.2、0.4、0.8、1.0 mg/ml共 4組，同時設置只加培養(yǎng)基的空白孔，每個藥物組和空白組都設 5個復孔，繼續(xù)培養(yǎng);作用 24、36、48和 72 h后于實驗各孔分別加CCK-8試劑 10μl，37℃繼續(xù)孵育 4 h，酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔的吸光度值(測定波長 450 nm，參比波長 650 nm)。以時間為橫坐標，細胞 OD值為縱坐標繪制細胞生長抑制曲線;以時間為橫坐標，細胞增殖抑制百分率(%)=(1-實驗細胞 OD值/對照細胞 OD值)×100%為縱坐標繪制 MSE對 SW480細胞增殖的抑制率曲線。

1.2.4 細胞凋亡的形態(tài)學特征觀察 在人結腸癌SW480細胞中加入含不同濃度 MSE的 10%FBS RPMI1640培養(yǎng)液 ，設置成 0.2、0.4、0.8、1.0 mg/ml，以不含 MSE的 10%FBSRPMI1640培養(yǎng)液為對照組，培養(yǎng) 12、24、48 h后于倒置顯微鏡下觀察。2.5 ml培養(yǎng)液(含細胞 4×106/ml)培養(yǎng)于 6孔板，不加藥組為對照;于加藥 12、24、48 h后 ，用 PBS洗滌 2次，Hoechest33258染色，熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學改變和凋亡小體的形成。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 實驗分組及細胞處理同前，培養(yǎng) 24 h后，收集 SW480細胞，用預冷的 PBS緩沖液洗細胞 2次;再用 1×Binding Buffe制成 1×106/ml的懸液，加入 AnnexinV-PE與核酸染料 7AAD，輕輕混勻，室溫避光處放置 15 min，加入 400μl 1×Binding Buffer，流式細胞儀測定結果。

1.2.6 MSE對 SW480細胞 Caspase-3活性的影響將 SW480細胞消化、吹勻后分別轉入 75 cm2培養(yǎng)皿中，每瓶細胞數(shù)相等，約 1×107，培養(yǎng)液量 5 ml。按預設終濃度加入 MSE，37℃、5%CO2孵箱中孵育 24 h。2.5 g/L胰酶消化細胞，收集入 15 ml離心管中，4℃離心。細胞置于冰浴中，冷 PBS液洗 2遍，離心，棄上清。每管加入 Cell lysis buffer，調整細胞濃度為1×1010/L。反復凍融以裂解細胞(置于液氮中迅速冷凍，室溫下融化)，于冰中孵育 15 min。14 000 r/min，4℃離 20 min，收集上清液于 Ep管中。用 Bradford法測定蛋白濃度，按說明書設置反應體系，37℃孵 2 h，酶標儀測定 A405，根據(jù)測得的吸光度值計算單位質量蛋白中所含 Caspase-3的酶活力。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件，結果以±s表示，所測數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。P≤0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MSE對 SW480細胞生長的抑制作用 不同濃度的 MSE作用于 SW480細胞 24、48、72 h，0.2 mg/ml以上濃度的 MSE對細胞的生長有明顯的抑制作用，0.2～1.0 mg/ml表現(xiàn)為時間和濃度的依賴性。隨藥物作用時間延長和濃度增加，細胞生長抑制率逐漸升高，MSE作用 72 h生長抑制最明顯。1.0 mg/ml的 MSE作用 72 h的細胞生長抑制率明顯高于其他濃度藥物的抑制率(P均 ＜0.01)，最高可達60%以上。見圖1。

圖1 MSE對 SW 480細胞的生長抑制作用

2.2 細胞凋亡的形態(tài)學特征 用 0.2 mg/ml MSE作用 24 h后，即可出現(xiàn)凋亡細胞形態(tài)學改變，主要表現(xiàn)為胞核濃縮及核碎裂等改變，而未加 MSE組的細胞質、胞核均呈均一的藍色。

2.3 MSE對 SW480細胞凋亡的影響 不同濃度的MSE(0.2～1.0 mg/ml)作用 SW480細胞 24 h后 ，細胞早期凋亡率分別為(16.39±1.84)%、(19.92±1.85)%、(11.92±2.41)%和(11.08±2.52)%;細胞晚期凋亡率分別為(4.02±0.67)%、(4.24±0.42)%、(14.34±3.19)%和(20.88±4.07)%?？瞻讓φ战M 24 h后細胞早期和晚期凋亡率分別為(3.32±0.75)%和(0.96±0.45)%。表明隨著藥物濃度的增加，SW480細胞凋亡率逐漸增加，且細胞逐漸從早期凋亡走向晚期凋亡，與其增殖抑制作用一樣，也呈濃度—效應依賴性。

2.4 MSE對 Caspase-3蛋白酶活性的影響 空白對照組與不同濃度的 MSE(0.2～1.0 mg/ml)作用SW480細胞 24 h后，Caspase-3蛋白酶活性分別為(11.31±0.79)、(22.76±8.27)、(26.62±8.08)、(34.11±4.47)、(36.69±2.96)U/mg。不同濃度MSE作用組與空白對照組比較均有統(tǒng)計學差異(P均 ＜0.05)，并呈濃度依賴性。

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學研究證實，芥菜籽中的異硫氰酸酯、谷甾醇等成分均有較好的抗癌活性[5]。我們研究發(fā)現(xiàn)，MSE體外對人結腸腺癌細胞株 SW480細胞有抑制生長作用，抑制率隨藥物濃度的增加而增加，具有劑量依賴關系;隨著作用時間的延長而增加，具有時間依賴關系。用 Hoechest33258染色后在熒光顯微鏡下觀察到 MSE組出現(xiàn)大量的胞核濃縮、核碎裂及染色體邊集濃染的凋亡細胞。AnnexinV-PE/7AAD雙染流式細胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)細胞凋亡率隨 MSE濃度的增加而逐漸增加，且細胞逐漸從早期凋亡走向晚期凋亡，呈濃度—效應依賴性。表明 MSE對 SW480細胞的生長抑制作用可能是通過凋亡誘導途徑來實現(xiàn)。

細胞凋亡途徑主要有 2條，一條是通過細胞膜上的死亡受體激活 Caspase，另一條是通過胞質內的線粒體途徑釋放細胞凋亡因子激活 Caspase，而內質網(wǎng)的凋亡信號途徑往往歸并于線粒體途徑。雖然誘發(fā)凋亡的信號及其途徑千差萬別，但是凋亡執(zhí)行者Caspase卻是相同的，Caspase系列下游分子Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12分別在死亡受體途徑、線粒體途徑及內質網(wǎng)途徑中擔當著分子開關的角色[6]。而 Caspase-3作為凋亡效應蛋白是細胞凋亡 3條途徑的共同下游通路，是 Caspase酶聯(lián)反應的終末因子[7]。正常情況下 Caspases以無活性的酶原形式存在，在凋亡誘導信號作用下，通過蛋白水解去除氨基端的一段序列而被激活，激活的Caspase-3裂解細胞的關鍵結構蛋白和看家蛋白。因此，Caspase-3目前認為是在 Caspase家族中多種誘導劑刺激后導致凋亡的關鍵酶。為了進一步證明MSE對細胞的凋亡誘導作用和推測其凋亡作用的機制，我們對 Caspase-3蛋白酶的活力進行了測定。結果顯示在 24 h內 MSE作用于 SW480細胞組較對照組 Caspase-3活性明顯增強。由此可見，Caspase-3參與 MSE誘導的 SW480細胞凋亡。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅與腫瘤細胞分化異常、細胞增殖過度有關，而且與細胞凋亡減少有關[8]。目前臨床上應用很多的抗腫瘤藥如 5-FU、順鉑、絲裂霉素等被發(fā)現(xiàn)均可誘導腫瘤細胞凋亡，誘導凋亡是其抗腫瘤的重要機制之一。本研究表明這也是MSE抗結腸癌的一個作用機制。MSE多種活性成分到底是何成分中有誘導凋亡作用尚不清楚，有待進一步研究。

[1]Uhl M，Laky B，Lhoste E，et al.Effects of mustard sproutsand allylisothiocyanate on benzo(a)pyrene-induced DNA damage in human-derived cells:amodel study with the single cell gel electrophoresis/Hep G2assay[J].Teratog Carcinog Mutagen， 2003，23(Suppl1):273-282.

[2]Gagandeep，Dhiman M，Mendiz E，et al.Chemopreventive effects of mustard(Brassica compestris)on chemically induced tumorigenesis in murine forestomach and uterine cervix[J].Hum Exp Toxicol，2005，24(6):303-312.

[3]Eskin NA，Raju J，Bird RP.Novel mucilage fraction of Sinapis alba L.(mustard)reduces azoxymethane-induced colonic aberrant crypt foci formation in F344 and Zucker obese rats[J].Phytomedicine，2007，14(7-8):479-485.

[4]Wu GX，Lin YX，Ou MR，et al.An experimental study(II)on the inhibition of prostatic hyperplasia by extract of seeds of Brassicaalba[J].Zhongguo Zhongyao Zazhi，2003，28(7):643-646.

[5]Palomares O，Vereda A，Cuesta-Herranz J，et al.Cloning，sequencing and recombinant production of Sin a 2，an allergenic 11S globulin from yellow mustard seeds[J].Allergy Clin Immunol，2007，119(5):1189-1196.

[6]Hitomi J，Katayama T，Taniguchi M，et al.Apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress depends on activation of caspase-3 via caspase-12[J].Neuroscience Letters，357(2003):127-130.

[7]Qin YF，Bi DD.Effect of propolis flavonoids on the apoptosis of neuron and expression of caspase-3，bcl-2 and bax following focal cerebral ischemia-reperfusion in rats[J].Chinese Journal of Clinicians 2010，4(7):1023-1027.

[8]Qiao L，Wong BC.Targeting apoptosis as an approach for gastrointestinal cancer therapy[J].Drug resistance updates，2009，3(12):55-64.