(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，西寧 810001)

心律失常為人類猝死的主要原因，其發(fā)生、發(fā)展與心肌細胞膜上的離子電流改變密切相關(guān)，心肌細胞膜上的離子通道為心律失常發(fā)生的重要靶點和抗心律失常藥物的作用靶點［1］。HERG(human ether a go-go related gene)編碼心肌快速激活的延遲整流鉀通道(IKr)的α亞基，在心肌細胞的復(fù)極化過程中發(fā)揮重要作用，既是抗心律失常藥物作用的重要靶點，也是產(chǎn)生致死性心律失常的分子靶點［2］。木蘭花堿(又名木蘭堿，別名唐松草堿)是毛茛科植物粗果唐松草的根街植物中主要的活性物質(zhì)，具有抗炎、降壓、抑制腫瘤細胞生長及抗心律失常等作用［3，4］，但其對HERG鉀通道蛋白(以下簡稱HERG蛋白)表達的影響鮮見報道。2010年12月～2011年6月，我們觀察了不同濃度木蘭花堿對HERG蛋白表達的影響，旨在探討木蘭花堿抗心律失常的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞:HEK-293細胞株(中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué))，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 HERG基因重組載體的HEK-293細胞(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所)。藥品與試劑:胎牛血清(上海華壹生物科技有限公司);DMEM培養(yǎng)基(上海滬峰生物科技有限公司，含10% 胎牛血清和400 μmol/L G418);抗HERG的多克隆兔抗體(1∶200，北京博奧森生物技術(shù)有限公司);木蘭花堿標準品(中國藥品生物制品檢定所，實驗前用PBS溶解，過0.22 μm微孔濾膜，無血清培養(yǎng)基稀釋，使終濃度分別為 1、3、10、30 μmol/L;1、3 μmol/L 為低濃度，10、30 μmol/L 為高濃度。

1.2 細胞培養(yǎng)及 HERG蛋白測定 將 HERGHEK-293細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，HEK-293細胞培養(yǎng)于上述不含G418的培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2飽和濕度孵育培養(yǎng)箱培養(yǎng)，消化傳代，取對數(shù)生長期細胞采用Western blot蛋白印跡法測定HERG蛋白表達。結(jié)果證實HEK-293細胞中沒有HERG蛋白表達;而HERG-HEK-293細胞中存在HERG蛋白表達，共發(fā)現(xiàn)兩條帶，一條帶的相對分子質(zhì)量約為155 kD，另一條帶的相對分子質(zhì)量在135 kD附近，見圖1A。

1.3 細胞干預(yù)及HERG蛋白測定 ①蛋白印跡法:將對數(shù)生長期HERG-HEK細胞分別以空白培養(yǎng)基和含木蘭花堿1、3、10、30 μmol/L的培養(yǎng)基中孵育24 h，PBS收集細胞并提取總蛋白，用Bradford法行蛋白定量。測定HERG蛋白表達:取等量樣品，加入等體積上樣緩沖液，煮樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉［5］，加入一抗(1∶2 00)，室溫孵育2 h，用PBS-T緩沖液洗膜3次，每次10 min，用紅外熒光標記的羊抗兔二抗(1∶4 000)避光孵育1 h，用PBS-T緩沖液洗膜3次，每次15 min，再用PBS緩沖液洗膜10 min。用圖像分析軟件Scion Image計算光密度積分值。②免疫熒光法:將對數(shù)生長期HERG-HEK細胞稀釋至鋪有蓋玻片的6孔板中培養(yǎng)。待細胞爬片貼壁后，分別以空白培養(yǎng)基和木蘭花堿 1、3、10、30 μmol/L的無血清培養(yǎng)基孵育24 h。依次進行固定、穿透、封閉［5］，一抗(1∶200)4 ℃孵育過夜，用 PBS沖洗 3次，每次 5 min，加入熒光標記的羊抗兔抗體(1∶200)，室溫避光反應(yīng)2 h。用PBS沖洗3次后利用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以±s表示，采用Students't檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛋白印跡法 低濃度木蘭花堿不影響HERG蛋白的表達(P＞0.05)，高濃度的木蘭花堿顯著抑制 HERG 蛋白，P ＜0.01。1、3、10、30 μmol/L 的木蘭花堿作用后HERG蛋白表達的光密度積分值分別為 1.01、1.03、0.71 和 0.69。高濃度與低濃度比較，P ＜0.01。

2.2 免疫熒光法 顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，低濃度木蘭花堿熒光強度與對照組相比并無明顯變化，隨木蘭花堿濃度升高，細胞膜上的熒光強度逐漸減弱，與蛋白印跡法結(jié)果一致。

3 討論

HERG蛋白屬于N連接糖蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其細胞外部分存在兩個糖基化的位點(N598，N629)，N連接糖基化與HERG通道的穩(wěn)定性有密切關(guān)系，控制蛋白質(zhì)的折疊、運輸、修飾、以及使其免受蛋白酶的降解［6］。HERG蛋白在轉(zhuǎn)運至細胞膜前，需要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，經(jīng)高爾基復(fù)合體的修飾加工，在這個過程中，發(fā)生錯誤的折疊或裝配不完全的蛋白會在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被質(zhì)量控制識別并使其潴留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被降解，其中質(zhì)量控制機制包括伴侶蛋白控制和蛋白酶降解，均可以影響成熟蛋白的表達。近年來發(fā)現(xiàn)，HERG鉀通道在心律失常的發(fā)生與治療中起雙重作用，HERG缺陷可引起先天性QT間期延長綜合征(LQTS)，同時某些藥物通過阻斷鈣通道，抑制HERG蛋白表達，可引起獲得性LQTS，甚至引起猝死［7，8］。即HERG鉀通道不僅是抗心律失常藥物作用的一個重要靶點［1］，也是產(chǎn)生致命性心律失常的分子靶位。因此對HERG鉀通道的研究將有助于開發(fā)更安全、更高效的抗心律失常藥物。

木蘭花堿屬于雙芐基異喹啉類生物堿，具有良好的抗心律失常作用［2］。但其具體的分子機制及細胞生物學(xué)機制并未完全闡明。本研究采用針對N末端的HERG通道蛋白抗體作為一抗，蛋白印跡法發(fā)現(xiàn)HERG-HEK-293細胞存在兩條帶，其中相對分子質(zhì)量為155 kD的蛋白為HERG通道完全糖基化形式，即該通道的成熟形式，主要定位于細胞膜上;而相對分子質(zhì)量為135 kD的蛋白為HERG通道核心糖基化的形式，即成熟通道的前體，主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體中［9］。高濃度木蘭花堿作用后HERG蛋白表達明顯受抑。

本研究證實，高濃度木蘭花堿可明顯抑制HERG蛋白表達，此可能為其抗心律失常的分子機制。本研究為木蘭花堿的安全性應(yīng)用提供了理論支持。

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