譚建軍，林 榮，侯俊丞，董浦江

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬三臺醫(yī)院血液內(nèi)科，四川三臺 621100;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，重慶市普外科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是起源于B細(xì)胞的惡性腫瘤。好發(fā)于中老年人，以骨痛為主要臨床表現(xiàn)［1］。誘導(dǎo)分化治療多發(fā)性骨髓瘤是一新的治療領(lǐng)域。衣霉素(tunicqamycin，TM)是一核苷抗生素，它可通過抑制蛋白糖基化途徑中的十四糖二磷酸長萜醇的生成，形成脫糖蛋白，阻礙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)新生蛋白質(zhì)糖基化修飾，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子紊亂和未折疊蛋白蓄積，引起具有保護(hù)作用的未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)發(fā)生［2］。UPR在具有分泌抗體的細(xì)胞分化中有著重要作用。本實(shí)驗(yàn)在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重慶市普外科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，我們以小劑量TM誘導(dǎo)RPMI-8226細(xì)胞，探討TM在誘導(dǎo)分化治療多發(fā)性骨髓瘤中的機(jī)理，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

鼠抗人XBP-1u蛋白抗體、兔抗人CD49e抗體、兔抗人β-actin蛋白抗體(美國Santa cruz公司)，衣霉素(美國sigma公司)，測定免疫球蛋白輕鏈ELIAS試劑盒(美國GE公司)，APAAP試劑盒(醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物制劑中心)，電泳試劑盒(武漢博士得公司)，發(fā)光試劑盒(美國GE公司)，蛋白提取液(武漢博士得公司)，圖像分析系統(tǒng)(美國BID-RAD公司Chemi DOCXRS)。

1.2 RPMI-8226細(xì)胞

為多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株，購自中國醫(yī)科院細(xì)胞庫。用含10%FBS的1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，成對數(shù)生長期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組加TM，其終濃度0.4μmol/L，分別繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)與72小時(shí)。對照組加TM溶劑。

1.3 RPMI-8226細(xì)胞CD49e表達(dá)率測定

2%胰酶消化實(shí)驗(yàn)組及對照組細(xì)胞，將細(xì)胞滴加在多聚賴氨酸打底的載玻片上，推片，涼干后，CD49e抗體1∶100稀釋，具體按APAAP試劑盒說明書進(jìn)行操作，每張玻片在200倍光鏡下，計(jì)數(shù)上、下、左、右四個(gè)區(qū)域，100個(gè)細(xì)胞中呈棕色之細(xì)胞數(shù)，一式三份。

1.4 RPMI-8226細(xì)胞培養(yǎng)液中免疫球蛋白測定

12000r/min離心收集上述實(shí)驗(yàn)及對照組細(xì)胞培養(yǎng)液，按ELIAS試劑盒說明書進(jìn)行測定，一式三份。

1.5 XBP-1u蛋白表達(dá)測定

用細(xì)胞刮刮取上述實(shí)驗(yàn)組與對照組的RPMI-8226細(xì)胞，置EP管內(nèi)，震蕩混勻后置4℃、30分鐘，取勻漿置離心管中12000r/min離心20分鐘。取上清液測定蛋白含量，爾后用蛋白提取液將蛋白濃度均調(diào)至3mg/ml。將該組織液經(jīng)100g/L SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)于PVDF膜，50g/L脫脂奶粉的TBST溶液封閉，經(jīng)一抗及二抗孵育后，化學(xué)發(fā)光法顯色，圖像分析系統(tǒng)拍攝并用Quantity One軟件將特異條帶灰度數(shù)字化。

XBP-1u表達(dá)水平的相對值(XBP-1u蛋白表達(dá)系數(shù))為XBP-1u蛋白條帶灰度與內(nèi)參蛋白β-actin蛋白條帶灰度比值。(XBP-1u蛋白表達(dá)系數(shù)=XBP-1u蛋白積分光密度/β-actin蛋白積分光密度)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x－±s)描述，三組資料各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，兩輛比較采用SNK法。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RPMI-8226細(xì)胞CD49e表達(dá)率

對照組細(xì)胞CD49e表達(dá)率為7.8% ±2.3%，衣霉素處理48小時(shí)實(shí)驗(yàn)組CD49e表達(dá)率為25.3%±3.1%，衣霉素處理72小時(shí)實(shí)驗(yàn)組CD49e表達(dá)率為43.6% ±3.3%，對照組與兩實(shí)驗(yàn)組有顯著差異(p＜0.01)。

2.2 RPMI-8226細(xì)胞培養(yǎng)液中免疫球蛋白:

對照組培養(yǎng)上清液免疫球蛋白輕鏈含量為(182±25)mg/L，衣霉素處理48小時(shí)實(shí)驗(yàn)組為(311±19)mg/L，衣霉素處理72小時(shí)實(shí)驗(yàn)組為(405±23)mg/L。對照與兩實(shí)驗(yàn)組差異均有顯著性(p＜0.01)。

2.3 XBP－1u蛋白表達(dá)

對照組、衣霉素處理48小時(shí)、72小時(shí)實(shí)驗(yàn)組XBP-1u蛋白表達(dá)，見圖1。對照組XBP-1u蛋白表達(dá)系數(shù)為0.16±0.10，衣霉素處理48小時(shí)實(shí)驗(yàn)組XBP-1u蛋白表達(dá)系數(shù)為0.53±0.17，衣霉素處理72小時(shí)實(shí)驗(yàn)組 XBP-1u蛋白表達(dá)系數(shù)為0.93±0.15。對照與兩實(shí)驗(yàn)組差異均有顯著性(p＜0.01)。

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤是骨髓內(nèi)漿細(xì)胞異常增生的一種惡性腫瘤，目前鮮有有效的治療手段［3］。尋找安全有效的誘導(dǎo)分化治療多發(fā)性骨髓瘤具有重要的臨床意義。真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)承擔(dān)著新生蛋白質(zhì)的折疊、組裝和運(yùn)轉(zhuǎn)，某些疾病時(shí)會(huì)產(chǎn)生未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白，人類和小鼠細(xì)胞內(nèi)存在一種機(jī)制，即通過調(diào)整內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白的數(shù)量與加強(qiáng)折疊能力緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，該機(jī)制即UPR，UPR可用于保持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)定和阻止細(xì)胞凋亡，這機(jī)制可能是多種疾病的病原學(xué)基礎(chǔ)［4］。有文獻(xiàn)報(bào)道UPR在分泌抗體的細(xì)胞(如漿細(xì)胞)分化中起重要作用［5］。X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP1)作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與 UPR的調(diào)節(jié)［6］。XBP-1s與 XBP-1u分別是XBP-1的剪切體與未剪切體，分別由376及260個(gè)氨基酸組成。有研究者［7］發(fā)現(xiàn)XBP-1s在骨髓瘤原代細(xì)胞中較正常漿細(xì)胞表達(dá)高，并在轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)XBP-1s可促進(jìn)小鼠骨髓瘤的發(fā)病，故認(rèn)為XBP-1s與骨髓瘤的發(fā)病相關(guān)。作者用衣霉素處理 RPMI-8226細(xì)胞后，RPMI-8226細(xì)胞的CD49e陽性率增加，其培養(yǎng)液中的免疫球蛋白輕鏈含量增高，且該現(xiàn)象隨處理時(shí)間延長而更明顯。CD49e陽性的骨髓瘤細(xì)胞是成熟細(xì)胞，能分泌更多的免疫球蛋白。該現(xiàn)象說明RPMI-8226細(xì)胞經(jīng)小劑量衣霉素處理后，向成熟階段分化。同時(shí)處理后的RPMI-8226細(xì)胞XBP-1u蛋白表達(dá)增高，XBP-1u可激活哺乳動(dòng)物體內(nèi)UPR，在UPR中起反饋調(diào)節(jié)，與細(xì)胞的分化相關(guān)［8］，顯示該細(xì)胞向成熟階段分化與XBP-1u蛋白表達(dá)增高引發(fā)UPR相關(guān)。綜上所述，用小劑量的UPR誘導(dǎo)劑－衣霉素可使RPMI-8226細(xì)胞RPMI-8226細(xì)胞的XBP-1u蛋白表達(dá)增高，從而誘導(dǎo)該細(xì)胞向成熟細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

針對UPR途徑靶向治療多發(fā)性骨髓瘤是一新的治療途徑［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示該方法具有應(yīng)用前景。

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