張明霞，劉崇懷，張 靜，樊秀彩

(1.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，河南 鄭州 450009)

桑葉葡萄和刺葡萄果皮中酚類物質(zhì)的組成分析

張明霞1，劉崇懷2，張 靜1，樊秀彩2

(1.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，河南 鄭州 450009)

采用超聲波輔助法，利用甲醇從桑葉葡萄和刺葡萄果皮中提取花色苷，利用乙酸乙酯從兩種葡萄果皮中提取非花色苷，液質(zhì)聯(lián)用定性定量分析兩種葡萄果皮中花色苷及非花色苷酚的組成。桑葉葡萄果皮共檢測(cè)出花色苷20種，非花色苷酚6種。刺葡萄果皮中共檢測(cè)出花色苷6種，非花色苷酚15種。刺葡萄果皮中主要的花色苷是花翠素3,5-二葡萄糖苷和二甲花翠素3,5-二葡萄糖苷，而桑葉葡萄果皮以二甲花翠素3,5-二葡萄糖苷和3'甲基花翠素-3,5-二葡萄糖苷為主。兩種野生葡萄果皮中主要的非花色苷酚是阿魏酸酒石酸酯及其衍生物，阿魏酸己糖酯和槲皮素-3-O-鼠李糖苷，刺葡萄果皮中非花色苷酚的含量比桑葉葡萄中的多。

桑葉葡萄；刺葡萄；花色苷；非花色苷；液質(zhì)聯(lián)用

葡萄野生種主要分布在東亞和北美[1]，并且集中分布在中國(guó)和美國(guó)，我國(guó)是世界葡萄屬植物種質(zhì)資源最豐富的國(guó)家之一，也是東亞葡萄種群的原產(chǎn)大國(guó)[2]，我國(guó)野生葡萄具有多種抗逆性狀和優(yōu)良農(nóng)藝性狀[3]。刺葡萄原產(chǎn)中國(guó)，屬東亞種群，是我國(guó)5種主要野生葡萄品種之一，自身抗病性極強(qiáng)，是具有地方特色和優(yōu)勢(shì)的資源。桑葉葡萄是毛葡萄的一個(gè)亞種，葉片較毛葡萄大，主要分布與華北、華東北部及陜、鄂等地[4]。

酚類物質(zhì)是葡萄中重要的次生代謝產(chǎn)物，分為花色苷 (主要為色素)和非花色苷酚 (無(wú)色酚類)，主要存在于葡萄籽與葡萄皮中，有資料表明，紅葡萄的果皮中，酚類物質(zhì)含量可達(dá)25%～50%，具有廣闊的開發(fā)前景[5-6]。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)法可用于酚類物質(zhì)具體成分分析，目前主要用高效液相色譜結(jié)合紫外或質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定[7-8]。反相高效液相色譜(RP-HPLC)配備二極管陣列檢測(cè)器(DAD)，具有易操作，靈敏度高和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，而且可以區(qū)分結(jié)構(gòu)類似的單一酚類物質(zhì)，因此近年來(lái)在分析測(cè)定果蔬等植物組織中的酚類組分方面得到了較快的發(fā)展，目前已成功應(yīng)用于蘋果、梨、菠蘿等多種水果中酚類物質(zhì)組成的分析[7]。本實(shí)驗(yàn)利用甲醇提取花色苷，乙酸乙酯提取非花色苷，HPLC-MS分析提取到的花色苷和非花色苷物質(zhì)的組成，對(duì)種植資源庫(kù)保藏的兩個(gè)野生品種的品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉葡萄、刺葡萄2009年摘自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹所葡萄種植資源庫(kù)。

沒食子酸、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、甲醇(均為分析純)，甲醇(色譜純)用于定容多酚濃縮物?；ㄉ諛?biāo)樣二甲花翠素3,5-二葡萄糖苷 Extrasynthese SA公司；兒茶素、槲皮素、沒食子酸、咖啡酸和白藜蘆醇標(biāo)樣Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；722N型紫外-可見光分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；1100系列LC/DAD/MSD液質(zhì)聯(lián)用儀、Zorbax SB C18柱(250mm×4.6mm，5μm) Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄果實(shí)物理指標(biāo)測(cè)定的方法

每個(gè)品種的葡萄隨機(jī)摘取100粒果實(shí)，稱果實(shí)、果皮和果籽的質(zhì)量，葡萄果皮用液氮冷凍粉碎，真空冷凍干燥后低溫保藏備用。

1.3.2 葡萄皮花色苷的提取

準(zhǔn)確稱取0.5g凍干的果皮粉，加入的甲酸-甲醇(1∶49，V/V)溶液10mL，超聲波輔助提取3min(25℃)，4000r/min離心5min，收集上清液，殘?jiān)性偌尤?0mL提取液，重復(fù)提取5次，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮提取液(25℃)，色譜純甲醇定容至5mL，置于-20℃冰箱備用，每個(gè)提取做兩次重復(fù)。

1.3.3 葡萄皮非花色苷的提取

準(zhǔn)確稱取2.5g果皮干粉，加入的水-乙酸乙酯(1∶9，V/V)溶液25mL，置于振蕩器中160r/min，25℃萃取30min，收集上清液，殘?jiān)性偌尤?5mL提取液，重復(fù)提取5次。5次提取收集的上清液置于250mL分液漏斗中靜置分層，下層水相用25mL的乙酸乙酯洗滌兩次，合并后的乙酸乙酯提取液利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀25℃濃縮，甲醇定容至2.5mL，置-20℃冰箱備用。每個(gè)提取做兩次重復(fù)。

1.3.4 HPLC-MS分析花色苷的條件

實(shí)驗(yàn)采用HPLC-MSD離子阱液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以及實(shí)際樣品的LC-UV-MS分析。色譜柱采用反相的Zorbax SB C18柱。流動(dòng)相A為1.0%的甲酸溶液，流動(dòng)相B為水-甲醇-甲酸(40∶50∶10)；洗脫程序：0～4min，6%～15% B；4～13min，15%～25% B；13～20min，25%～50% B；20～35min，50%～80% B；35～40min，80%～100% B；40～45min，100%～6% B；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：525nm；進(jìn)樣量：10μL。MSD參數(shù)：離子源為ESI，采用正離子模式；霧化氣壓力為30psi；干燥氣流速為10mL/min；干燥氣溫度為300℃；離子掃描范圍為m/z100～1500。CID的MS/MS誘導(dǎo)碰撞能量為1.0V。樣品0.45μm膜過濾后直接進(jìn)樣分析，每樣品重復(fù)兩次。

1.3.5 HPLC-MS分析非花色苷的條件

儀器配置同1.3.4節(jié)。色譜柱采用反相的Zorbax SB C18柱；流動(dòng)相A為1.0%的醋酸溶液，流動(dòng)相B為1.0%醋酸甲醇溶液；洗脫程序：0～15min，10%～26% B；15～30min，26%～40% B；30～50min，40%～65% B；50～60min，65%～95% B；60～63min，95%～10% B；63～66min，10% B；流速1.0mL/min；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；進(jìn)樣量：10μL。MSD參數(shù)：離子源為ESI，采用負(fù)離子模式；霧化氣壓力為30psi；干燥氣流速為10mL/min；干燥氣溫度為325℃；離子掃描范圍為m/z 100～1500。CID的MS/MS誘導(dǎo)碰撞能量為1.0V。樣品0.45μm膜過濾后直接進(jìn)樣分析，每樣品重復(fù)兩次。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉葡萄與刺葡萄的理化指標(biāo)

表1 桑葉葡萄與刺葡萄理化指標(biāo)的比較Table 1 Physico-chemical characteristics of Vitis ficifolia Bge and Vitis davidii Foex fruits

由表1可見，桑葉葡萄的果粒小，百粒果實(shí)、果皮和果籽的質(zhì)量明顯低于刺葡萄，但它的果皮和果籽占整果的比例比較大，而且二者均比刺葡萄的大。

2.2 桑葉葡萄與刺葡萄果皮中花色苷組成的分析結(jié)果

利用HPLC-MS對(duì)桑葉葡萄和刺葡萄的果皮甲醇提取液的花色苷類物質(zhì)組成進(jìn)行了分析。根據(jù)物質(zhì)的色譜信息、質(zhì)譜信息和光譜信息，對(duì)化合物進(jìn)行定性[9-10]。利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立的6個(gè)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)定性出的化合物進(jìn)行定量分析，結(jié)果見表2。

桑葉葡萄和刺葡萄果皮中共檢測(cè)出22種花色苷，其中有2種單葡萄糖苷的花色苷，4種C3,5-雙葡萄糖苷的花色苷和16種?；幕ㄉ?包括2種乙酰化葡萄糖苷、4種咖啡酰化葡萄糖苷、10種香豆酰化葡萄糖苷)。桑葉葡萄果皮中花色苷的種類多，共檢測(cè)到20種，總量約5841.36mg/kg，主要為花翠素3,5-二葡萄糖苷1916.46mg/kg、二甲花翠素3,5-二葡萄糖苷1767.65mg/kg、3'甲基花翠素3,5-二葡萄糖苷602.63mg/kg。刺葡萄果皮中檢測(cè)到6種花色苷，總量約598.71mg/kg，主要為二甲花翠素3,5-二葡萄糖苷303.70mg/kg、二甲花翠素3-反式香豆?；咸烟擒?5-葡萄糖苷207.55mg/kg。刺葡萄果皮中所含3中花色苷酚類物質(zhì)在桑葉葡萄果皮中均含有。桑葉葡萄和刺葡萄果皮中雙葡萄糖苷所占比例分別為95.5%、95.7%，可見兩種葡萄果皮中的花色苷酚類物質(zhì)主要為雙葡萄糖苷。

表2 兩種葡萄果皮花色苷酚類物質(zhì)的HPLC-MS分析結(jié)果Table 2 HPLC-MS analysis of anthocyanins in Vitis ficifolia Bge and Vitis davidii Foex fruit skins

葡萄中的花色苷，主要存在于紅葡萄漿果的表皮層中。葡萄果皮中花色苷的組成主要由基因控制，具有比較強(qiáng)的遺傳穩(wěn)定性，因此花色苷的種類在葡萄種和品種間差異較大。成熟度、季節(jié)氣候、產(chǎn)區(qū)、栽培模式和產(chǎn)量等因素對(duì)花色苷的含量有一定的影響[11-12]。C3,5-雙葡萄糖苷是美洲種葡萄、河岸葡萄、沙地葡萄、中國(guó)野生葡萄等的顯著特征。歐亞種葡萄中只含有單葡萄糖苷，不含雙葡萄糖苷。由于歐亞種葡萄主要作為釀酒原料，花色苷的組成研究的較為深入。Liang等[13]分析了110個(gè)葡萄品種的果皮中花色苷，其中中國(guó)野生品種V. amurensis var. dissecta的鮮果皮中花色苷含量最高，達(dá)到2.0g/kg。

2.3 桑葉葡萄與刺葡萄果皮中非花色苷酚類物質(zhì)組成的分析結(jié)果

表3 兩種葡萄果皮非花色苷酚類物質(zhì)的HPLC-MS分析結(jié)果Table 3 HPLC-MS analysis of non-anthocyanins in Vitis ficifolia Bge and Vitis davidii Foex fruit skins

利用HPLC-MS對(duì)兩種葡萄果皮乙酸乙酯提取液的非花色苷酚類物質(zhì)組成進(jìn)行了定性定量分析，結(jié)果見表3。桑葉葡萄和刺葡萄果皮中共檢測(cè)到17種非花色苷酚類物質(zhì)。桑葉葡萄果皮中檢測(cè)出的6種非花色苷酚類物質(zhì)中，主要為槲皮素-O-鼠李糖苷18.82mg/kg，斛皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷14.46mg/kg和槲皮素-3-O-葡萄糖苷9.02mg/kg，另外3種含量非常低。刺葡萄果皮中檢測(cè)出15種非花色苷酚類物質(zhì)，主要為阿魏酸酒石酸酯及其衍生物72.34mg/kg，阿魏酸己糖酯71.55mg/kg，槲皮素-O-鼠李糖苷45.36mg/kg。斛皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-O-鼠李糖苷在兩種葡萄果皮中均含有，但刺葡萄果皮中非花色苷酚類物質(zhì)的種類和含量均比桑葉葡萄的多。

兩種野生葡萄果實(shí)皮中的非花色苷酚主要由酚酸和黃酮醇兩類組成。酚酸屬于小分子化合物主要存在于葡萄細(xì)胞的液泡中，含量比較高的是羥基肉桂酸類的咖啡酸、阿魏酸、咖啡酰酒石酸酯等[14]。黃酮醇分布在葡萄果皮中，在葡萄多酚含量上占較大比例。兩種野生葡萄中檢測(cè)到的黃酮醇主要為3位上連接有不同糖苷的槲皮素。Jin等[14]分析的9種釀酒葡萄(干質(zhì)量計(jì))黃酮醇的量為90～1500mg/kg，桑葉葡萄和刺葡萄(干質(zhì)量計(jì))的大約為130和310mg/kg，與釀酒品種差別不大，尤其是桑葉葡萄具有豐富的花色苷資源，因此兩種野生葡萄也考慮作為釀酒原料[15-16]。

3 結(jié) 論

桑葉葡萄和刺葡萄鮮果皮中酚類物質(zhì)的組成存在明顯的差異，桑葉葡萄中花色苷的種類和含量均比桑葉葡萄中的多(均以鮮果皮質(zhì)量計(jì))，桑葉葡萄種花色苷的種類為20種，總量為5720.36mg/kg，而刺葡萄為6種，534.09mg/kg，桑葉葡萄果皮中的主要花色苷為花翠素3,5-二葡萄糖苷和二甲花翠素3,5-二葡萄糖苷，刺葡萄果皮的主要花色苷是二甲花翠素3,5-二葡萄糖苷和二甲花翠素3-反式香豆?；咸烟擒?5-葡萄糖苷。

刺葡萄果皮中非花色苷酚的組成比桑葉葡萄果皮的復(fù)雜，其中刺葡萄果皮中檢測(cè)出非花色苷酚15種，總量為254.42mg/kg，桑葉葡萄的共檢測(cè)出非花色苷6種，總量為42.30mg/kg。

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Composition Analysis of Phenols in Vitis ficifolia Bge and Vitis davidii Foex Fruit Skins

ZHANG Ming-xia1，LIU Chong-huai2，ZHANG Jing1，F(xiàn)AN Xiu-cai2
(1. School of Life Science and Technology, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China；2. Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450009, China)

Phenols are the most important components for maintaining high quality of grapes. The anthocyanins and nonanthocyanin phenolic compounds in the fruit skins of Vitis ficifolia Bge and Vitis davidii Foex were extracted with methanol and ethyl acetate under the assistance of ultrasonic respectively and their composition was qualitatively and quantitatively analyzed by high performance liquid chromatography mass spectrometry (HPLC-MS). As a result, 20 anthocyanins and 6 non-anthocyanin phenolic compounds were identified in Vitis ficifolia Bge fruit skin, and 6 anthocyanins and 15 non-anthocyanin phenolic compounds in Vitis davidii Foex fruit skin. The major anthocyanins in Vitis davidii Foex fruit skin were elphinidin-3,5-O-diglucoside and malvidin-3,5-O-di-glucoside, and in Vitis ficifolia Bge malvidin-3,5-O-di-glucoside and petunidin-3,5-O-diglucoside. Feruloytartaric acid and its derivatives, ferulic acid hexose ester and quercetin-O-rhamnoside were the major nonanthocyanin phenolic compounds in both species of wild grapes. The content of non-anthocyanin phenolic compounds in Vitis davidii Foex was much higher than that in Vitis ficifolia Bge.

Vitis ficifolia Bge；Vitis davidii Foex；anthocyanins；non-anthocyanin phenolic compounds；HPLC-MS

TS201.2

A

1002-6630(2011)14-0264-04

2010-10-12

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(葡萄)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(nycytx-30)

張明霞(1973—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工藝優(yōu)化控制。E-mail：zhangmingx@163.com