金 蓓，李 琳，李 冰，馮宗財，杜建中

啤酒混濁蛋白組分的分離鑒定

金 蓓1，李 琳2，李 冰2，馮宗財1，杜建中1

(1.湛江師范學院化學科學與技術學院，廣東 湛江 524048；2.華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640)

采用雙向電泳結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)技術分析確定引起啤酒混濁的蛋白組分。結(jié)果表明，僅有少量的蛋白組分參與啤酒混濁的形成。聚丙烯酰胺凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)MW 40kD左右，25～29kD和6.5～17kD作為啤酒混濁蛋白組分，可能主要來自麥芽中的水溶蛋白，小部分來自麥芽醇溶蛋白。雙向電泳分析證實了大部分的麥芽蛋白在釀造過程中發(fā)生降解和變性，并結(jié)合質(zhì)譜技術鑒定得到BTI-CMe、germin E (Hordeum vulgare)和 protein Z 3種組分可以抵抗釀造過程的熱變性和水解作用，將成為啤酒混濁形成重要的促進因子。

啤酒混濁；雙向電泳；質(zhì)譜；釀造過程；熱變性

現(xiàn)在瓶裝啤酒殺菌后出現(xiàn)混濁和在銷售過程中酒液產(chǎn)生沉淀、混濁、失光的現(xiàn)象，絕大多數(shù)是由于啤酒的膠體不穩(wěn)定性而引起的。因此，啤酒膠體穩(wěn)定性的研究，一直是啤酒行業(yè)重要的研究課題。通過對混濁物成分分析可知，導致啤酒混濁的主要原因是由含有高含量脯氨酸的蛋白質(zhì)與具有較高聚合度的多酚的復合物引起的[1-2]。啤酒中含有一定數(shù)量的大麥蛋白，這些蛋白在制麥和釀造過程中經(jīng)歷了化學變化和酶解而最終存留在啤酒中，并影響啤酒的混濁穩(wěn)定性和泡沫穩(wěn)定性[3-5]。

為了改善啤酒的膠體穩(wěn)定性，目前常采用皂土、硅膠和PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮)來提高啤酒的膠體穩(wěn)定性[6]。由于硅膠能夠吸附啤酒中混濁活性蛋白，然幾乎不能吸附泡沫活性蛋白[6-7]，所以硅膠吸附蛋白被公認為是啤酒混濁蛋白，但是目前仍沒有文獻指出啤酒混濁蛋白的準確組成，何種蛋白組分在影響啤酒混濁中占主導作用以及它們的來源，因而本實驗利用蛋白質(zhì)組學的方法即雙向電泳＋質(zhì)譜通過，探討硅膠吸附蛋白的精確組成，從而確定啤酒混濁活性蛋白組分，并進一步分析麥芽蛋白在釀造過程中的變化，為進一步闡述每一種混濁蛋白組分促進啤酒混濁形成的機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Baudin麥芽、麥汁、發(fā)酵液和啤酒等原料由珠江啤酒有限公司提供。

二硫蘇糖醇(電泳級)、碘乙酰胺(電泳級)、超純尿素(電泳級)、CHAPS(電泳級) 美國Sigma公司；苯甲基磺酰氟(電泳級) 加拿大BBI公司；礦物油(電泳級)、硫脲(電泳級) 美國Amresco公司；胰酶(質(zhì)譜級) 美國Promega公司。

1.2 儀器與設備

KDN-2C型定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；LGJ-10冷凍干燥機 北京四環(huán)科學儀器廠；冷凍離心機 日本Hitachi公司；電磁攪拌機 金壇市新一佳儀器廠；DYCZ-30型電泳槽、ECP3000三恒電泳儀 北京六一儀器廠；Versa Dco凝膠掃描系統(tǒng)、PDQUEST7.3 2D膠分析軟件、PH3-10固相化線性17cm干膠條 美國Bio-Rad公司；XW-80A型微型漩渦混合儀 上海愛朗儀器有限公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；IPGphor等電聚焦儀、Ettan Spot Picker切膠儀 瑞典Amersham Pharmacia 公司；Ettan DAL Tsix垂直板電泳儀 瑞典Amersham Pharmacia 公司；Beckman1765超速離心機 德國 Beckman公司；基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜儀 美國Thermo Finnigan公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白的提取

根據(jù)Osborne分類法[8]，取磨碎的麥芽粉0.1g，加1mL蒸餾水，室溫下提取1h，離心取上清液，作為水溶蛋白(清蛋白)；在沉淀中再添加5g/100mL NaCl溶液1mL，重復提取過程，上清液為鹽溶蛋白(球蛋白)；在沉淀中再添加70%乙醇溶液1mL，60℃水浴中提取1h，離心取上清液，獲得醇溶蛋白。

啤酒混濁蛋白的提取方法是依據(jù)E v a n s等[7]和Apperson等[9]的研究方法稍作修改。即將0.1g硅膠添加到200cm3的脫氣啤酒中，混合攪拌10min，然后13000r/min離心5min。棄去上清液，再將沉淀物加入新的200cm3的脫氣啤酒中，重復上述過程直至最初的0.1g硅膠完全暴露在4L啤酒中。然后加入0.2%氨水到沉淀顆粒中，混合攪拌，13000r/min離心10min，重復上述過程，回收上清液。最后在上清液中加入硫酸銨，混合攪拌30min，8000r/min離心10min，將沉淀充分溶解在40cm3去離子水中，透析，冷凍干燥得到最終的凍干蛋白粉。

1.3.2 氨基酸分析

采用高效液相色譜(HPLC)分析麥汁，發(fā)酵液和啤酒蛋白中的氨基酸組成。首先將凍干的蛋白粉用6mol/L HCl溶液于110℃水解24h，然后將水解液蒸干，用Agilent1100型高效液相色譜儀對氨基酸組成進行測定。氨基酸檢測條件： 采用TAG氨基酸分析柱，溫度為38℃，流速為1mL/min，檢測波長為254nm。

1.3.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

采用Laemmli[10]的電泳系統(tǒng)并進行改進，利用單向一步電泳方法分析啤酒混濁蛋白的組成。10%分離膠丙烯酰胺，2.5%濃縮膠，交聯(lián)度為2.6%，樣品提取液為：0.0625mol/L Tris-HCl、體積分數(shù)5%巰基乙醇、2%SDS、10%丙三醇、體積分數(shù)0.002%溴酚藍，pH6.8。1.3.4雙向電泳分析

第一向固相pH 梯度等電聚焦電泳(IPG-IEF) 每個樣品用水化液(7mol/L 脲、2mol/L硫脲、4% CHAPS、65mmol/L DTT、2% 載體兩性電解質(zhì)pH3～10，痕量溴酚蘭) 分別稀釋，渦旋混勻，12000r/min離心10min，取上清液上樣到等電聚焦盤中。每根17cm pH3～10 線性IPG預制膠條，考染蛋白質(zhì)上樣量為1mg，總上樣體積為350μL，梯度升壓，等電聚焦總伏小時為85kV·h。平衡后膠條轉(zhuǎn)移至15%SDS-PAGE上進行第二向電泳。開始時用10mA恒流30min，再用30mA恒流至電泳結(jié)束。最后凝膠采用質(zhì)譜兼容銀染色法染色。采用Melanie圖像分析軟件分析掃描圖像，進行強度校正、點檢測、背景消減、均一化和匹配等處理。

1.3.5 質(zhì)譜條件

切取需要分析的點，進行膠內(nèi)酶解，將提取肽段溶于50% ACN-5% TFA(三氟乙酸)中點樣于不銹鋼靶板。采用質(zhì)譜儀對處理好的樣品進行肽質(zhì)量指紋圖譜分析。離子源加速電壓為20kV，采用反射模式進行檢測，離子延遲時間100ns，真空度為4×10-7Torr，收集質(zhì)荷比在700～3500D范圍內(nèi)的信號峰，用胰蛋白酶自切峰作為內(nèi)標校正，利用Voyager-DE STR對所得到的峰圖進行分析。采用標準的檢索方法，在MASCOT (http:// www.matrixscience. com/)進行檢索，在NCBI nr 數(shù)據(jù)庫中搜索。

2 結(jié)果與分析

2.1 啤酒混濁蛋白組分分析

相對于啤酒蛋白含量(0.467g/L)而言，混濁蛋白(0.106g/L)僅占啤酒蛋白的較少的一部分，這也表明了僅有少量的啤酒蛋白參與了啤酒混濁的形成。Leiper等[11]報道混濁蛋白含量在麥汁煮沸和發(fā)酵過程中明顯降低，而啤酒混濁蛋白的含量極大地影響啤酒膠體穩(wěn)定性。脯氨酸和谷氨酸一直被認為是啤酒混濁蛋白的重要組成部分[12]。表1也證實了這一理論。啤酒混濁蛋白中脯氨酸和谷氨酸含量明顯高于啤酒中的含量而其他氨基酸組分含量卻相差無幾。而含硫氨基酸(蛋氨酸和半胱氨酸)是啤酒混濁蛋白中的第一限制性氨基酸。

表1 啤酒混濁蛋白中氨基酸含量測定Table 1 Contents of amino acids in beer haze

2.2 電泳分析

2.2.1 SDS-PAGE分析

圖1 啤酒混濁蛋白電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of beer haze proteins

由圖1可知，混濁蛋白包括了一系列廣泛的蛋白帶，其中大約40kD高強度的蛋白帶可以認為是主要的蛋白帶，通常這個蛋白帶被描述為protein Z。其他的蛋白帶包括6.5～17kD和25～29kD。然而，Leiper等[11]卻觀察到啤酒混濁蛋白包括46.9kD即protein Z，30.7、24.6、20.8、16.5、13.5kD，而其中參與混濁形成的重要的糖蛋白是16.5kD和30.7kD。啤酒混濁蛋白中40kD和25～29kD蛋白帶可能是來自麥芽中水溶性蛋白或醇溶蛋白，而6.5～17kD蛋白帶來自麥芽中水溶性蛋白，這表明了6.5～17kD和25～29kD蛋白帶與protein Z一樣可以抵抗釀造過程中的熱變性和酶解作用而存留在啤酒中，從而參與啤酒混濁的形成。

2.2.2 雙向電泳分析

由圖1可知，啤酒混濁蛋白中低分子質(zhì)量的蛋白帶在SDS-PAGE圖中分辨率較低，采用雙向電泳進一步探討啤酒混濁蛋白的組成。而且由于麥汁蛋白的組成極大地影響啤酒混濁蛋白的組成[25-26]，因而分別對啤酒麥汁蛋白和啤酒混濁蛋白進行2-D電泳分析，從而確定影響啤酒混濁的主要蛋白組分。利用Melanie分析軟件發(fā)現(xiàn)麥汁蛋白2-D電泳圖中大約有150個蛋白點，而在混濁蛋白電泳圖則存在大約60個蛋白點，且主要分布在10～75kD和pI4～8，其中高強度的蛋白點都集中在兩塊凝膠的40～60kD和pI4～6附近，這些符合protein Z的特性，據(jù)此可推測為這些蛋白點為protein Z。由圖2、3可知，protein Z區(qū)域在麥汁蛋白和混濁蛋白2-D圖中分辨率較差，即存在一個寬范圍、高強度的蛋白點。這可能是因為protein Z中的賴氨酸與糖分子發(fā)生部分的糖基化作用。

圖2 麥汁蛋白(A)和啤酒混濁蛋白(B)的2-D電泳圖Fig.2 Two-dimensional electrophoresis of wort protein and beer haze proteins

由圖2可發(fā)現(xiàn)，從銀染色凝膠中觀察到的蛋白模式的變化與釀造過程中發(fā)生的化學修飾密切相關。在麥汁蛋白的2-D電泳圖中還存在大約10個高分子質(zhì)量蛋白點主要分布在MW75～116kD范圍內(nèi)，而在啤酒混濁蛋白的2-D電泳圖中則觀察不到這些高分子蛋白點的存在。與麥汁蛋白電泳圖相比，發(fā)現(xiàn)在啤酒混濁蛋白電泳圖的pI5～8和分子質(zhì)量在10～20kD及25～35kD區(qū)域內(nèi)蛋白點數(shù)目明顯降低。在麥汁蛋白電泳圖中25～35kD區(qū)域內(nèi)檢測到大約32個蛋白點，同樣地，啤酒混濁蛋白電泳圖中此區(qū)域內(nèi)僅檢測到20個蛋白點；而在麥汁蛋白2-D圖中12～16kD區(qū)域內(nèi)檢測到大約20個蛋白點，啤酒混濁蛋白在此區(qū)域內(nèi)僅檢測到大約12個蛋白點。這一結(jié)果表明了大部分的蛋白組分不能承受釀造過程的熱變性和還原作用，證實了前面蛋白含量的測定和單向電泳分析。通過對比麥汁蛋白和混濁蛋白的2-D電泳圖可發(fā)現(xiàn)，高強度的蛋白點1 a、1 b、2 a、2 b、2 c、3、4均存在于這兩個電泳圖中。而且相對于麥汁蛋白2-D圖而言，蛋白點1a、1b、3強度加深，而2a、2b、2c、4強度減弱，證實了在釀造過程中高分子蛋白發(fā)生降解生成小分子蛋白，然而這一結(jié)果也說明了1a、1b、2a、2b、2c、3、4蛋白點可以抵抗釀造過程中的熱變性和酶解作用而存留在啤酒中，從而作為促進啤酒混濁的重要因子，即是最為重要的混濁活性蛋白。

2.3 質(zhì)譜分析

利用飛行質(zhì)譜來分析啤酒混濁蛋白中的蛋白點，以確定啤酒混濁蛋白主要的組成成分。根據(jù)圖象分析結(jié)果從啤酒混濁蛋白主要分布區(qū)域中選出一些極具代表性、清晰且較濃的與麥汁蛋白電泳圖相匹配的7個蛋白點(1a、1b、2a、2b、2c、3、4)，進行LCQ-DECAXPplus質(zhì)譜分析，得到相應肽分子質(zhì)量和肽序列標簽的蛋白質(zhì)，經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢得到相應的蛋白質(zhì)。

初步鑒定蛋白質(zhì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋白點1a、1b、3都被鑒定為BTI-CMe蛋白(屬于α-淀粉酶或胰蛋白酶抑制劑屬，也稱之為氯仿/甲醇可溶性蛋白)。相對醇溶蛋白而言，BTI-CMe是一種低分子質(zhì)量的鹽溶性并具有疏水特性蛋白，脯氨酸含量較低，屬于CM蛋白家族[13-16]。從理論上分析，它們類似于醇溶蛋白，這些疏水性蛋白或它們的疏水性部分能夠抵抗釀造過程中的熱變性和酶解作用，最終存在于啤酒中繼而參與啤酒混濁的形成。而蛋白點2a、2b、2c被鑒定為germin E(大麥屬)，germin實際上是一種草酸氧化酶(OXO)，屬于水溶性的同源六聚體糖蛋白。每個單體包含201個氨基酸殘基，分子質(zhì)量大約為26kD[17-18]。germin蛋白具有很高的單體表面包埋面積且在其蛋白結(jié)構存在疏水性區(qū)域，因而對熱、蛋白酶和其他變性劑都具有顯著的抗性[19-21]。而對比麥汁和啤酒混濁蛋白的2-D圖可發(fā)現(xiàn)，2a、2b、2c蛋白點強度減弱，這可能是由于germin的脯氨酸含量較低(大約8%)使得在這個區(qū)域內(nèi)的大部分蛋白組分在釀造過程中不容易發(fā)生糖基化作用。事實上，釀造過程中的還原條件和熱變性導致蛋白結(jié)構的展開，而糖基化可以結(jié)構展開的germin蛋白在釀造過程中以可溶狀態(tài)而存留在最終產(chǎn)品啤酒中。蛋白點4被鑒定為protein Z-type serpin (protein Z4)。protein Z屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，分為proteinZ4和proteinZ 7兩個小的基因?qū)賉22-23]。這些蛋白組分在釀造過程中，protein Z中16%的賴氨酸發(fā)生糖基化通過美拉德反應[24]。protein Z也是大麥蛋白中極少數(shù)幾個蛋白在啤酒中被識別出來的蛋白，并有助于改善啤酒的泡沫穩(wěn)定性以及參與啤酒混濁的形成[22-23]。因此，根據(jù)本研究中蛋白質(zhì)組學分析(雙向電泳和質(zhì)譜)發(fā)現(xiàn)啤酒中混濁活性蛋白組分包括3個重要的組成部分：protein Z，BTI-CMe蛋白，germin E。這一結(jié)果表明了這3種蛋白組分在啤酒混濁形成中起到至關重要的作用。

3 結(jié) 論

本研究采用電泳(單向電泳和雙向電泳)結(jié)合質(zhì)譜技術考察啤酒混濁蛋白組分在釀造過程的變化和鑒定其組成成分，其研究結(jié)果表明：1) 蛋白含量分析發(fā)現(xiàn)僅有少量的啤酒蛋白參與了啤酒混濁的形成，而氨基酸含量分析發(fā)現(xiàn)脯氨酸和谷氨酸作為啤酒混濁蛋白的主要組成。2)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)混濁蛋白包括了一系列廣泛的蛋白帶，即40kD左右，6.5～17kD和25～29kD，并發(fā)現(xiàn)這些混濁蛋白主要來自麥芽中的水溶蛋白組分，小部分是來自醇溶蛋白組分。3)2-D電泳分析發(fā)現(xiàn)混濁蛋白電泳圖大約有60個蛋白點，主要分布在10～75kD和pI4～8。對比分析麥汁和啤酒混濁蛋白的2-D圖發(fā)現(xiàn)，大部分蛋白點在釀造過程中發(fā)生變性和降解，并發(fā)現(xiàn)大約有7個高強度蛋白點經(jīng)得住釀造過程中的各種修飾反應而存在于啤酒混濁蛋白中成為影響啤酒混濁蛋白的主要組分。5)利用飛行質(zhì)譜技術對這7個蛋白點進行分析鑒定，確定啤酒中混濁活性蛋白組分包括3個重要的組成部分：protein Z、BTI-CMe蛋白、germin E。然而這些蛋白組分的來源以及它們在啤酒混濁形成過程中所起的作用仍有待于今后研究進一步的證實。

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Isolation and Identification of Haze Proteins in Beer

JIN Bei1，LI Lin2，LI Bing2，F(xiàn)ENG Zong-cai1，DU Jian-zhong1
(1. School of Chemistry Science and Technology, Zhanjiang Normal University, Zhanjiang 524048, China；2.College of Light Indusity and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

The two-dimensional electrophoresis (2-DE) and MALDI-TOF-MS were used to determine the compositions of haze proteins in beer. The results indicated that only small amount of proteins participated in the formation of beer haze. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) revealed the molecular masses of 40, 25-29 kD and 6.5-17 kD for bear haze protein fraction, which were originated primarily from water-soluble protein and ethanol-soluble protein in malt. The degradation and denaturation of malt proteins during the brewing process were confirmed by two-dimensional electrophoresis (2-DE) analysis coupled with mass spectrometry. Meanwhile, BTI-CMe, germin E (Hordeum vulgare) and protein Z were also validated to have the resistance to proteolysis and heat denaturation during brewing process, which might be important contributors to the formation of beer haze.

beer haze；two-dimensional gel electrophoresis；mass spectrometry；brewing process；denaturation

TQ93

A

1002-6630(2011)03-0086-05

2010-04-25

國家自然科學基金重點項目(20436020)；廣東省自然科學基金研究團隊項目(05200617)；

廣東高校優(yōu)秀青年創(chuàng)新人才培育項目(LYM09100)

金蓓(1981—)，女，講師，博士研究生，研究方向為植物蛋白科學與工程。E-mail：jinbeikim2007@yahoo.com.cn