王玥 李應(yīng)東

(甘肅中醫(yī)學(xué)院 蘭州 730060)

目前細胞培養(yǎng)技術(shù)已成為很重要的生物技術(shù)之一,它是醫(yī)學(xué)、新藥開發(fā)等實驗研究的基礎(chǔ)技術(shù),其作用不容忽視。人肝癌SMMC-7721細胞屬于肝癌細胞系,現(xiàn)已廣泛用于藥物毒理、抗腫瘤等方面的研究,目前關(guān)與人肝癌SMMC-7721細胞的培養(yǎng)文獻還比較少,我們對于人肝癌SMMC-7721細胞的培養(yǎng)條件和方法上進行了探索,現(xiàn)總結(jié)出一些經(jīng)驗。

1 資料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實驗細胞 人肝癌SMMC-7721細胞株由甘肅蘭州大學(xué)附屬二院泌尿研究所惠贈。

1.1.2 主要試劑 Dulbcco’s Modified Eagle’Medium(DMEM)培養(yǎng)基:北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司磷酸鹽緩沖液(PB S):氯化鈉8.00g、十二水磷酸氫二鈉2.885g、氯化鉀0.20g、磷酸氫二鉀0.20、三蒸水配制,0.22μm濾膜過濾除菌,PH7.2～7.4,4℃保存。新生牛血清(NBCS):杭州四季青生物材料工程研究所-20℃保存,使用前4℃溶解,56℃滅活30min。胰蛋白酶消化液:胰蛋白酶(T rypsin 1:250,GIBCO公司)用PBS液配制成濃度為0.25%溶液,0.22μm濾膜過濾除菌,4℃保存。青霉素、鏈霉素溶液:0.22μm濾膜過濾除菌,4℃保存。

1.1.3 實驗儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱:BB16UV德國Heraeus公司;超凈工作臺:VS-1300L型,蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限責(zé)任公司;倒置相差光學(xué)顯微鏡:IX71型,日本Olympus公司產(chǎn)品;恒溫水浴鍋:DZW-4型,金壇市恒豐儀器廠;純凈水系統(tǒng):Milli-Q Biocel美國Millipore公司;電熱恒溫干燥箱:風(fēng)熱式,101型,北京科偉永鑫實驗儀器設(shè)備廠;臺式滅菌器:TMQ.J-2540型,山東新華醫(yī)療器械股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SMMC-7721細胞的復(fù)蘇方法 將凍存的細胞用鑷子捏住在提前預(yù)熱的37℃水浴鍋中快速搖晃將細胞解凍,整個過程一般不要超過2min,然后將細胞用尖吸管轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中(復(fù)蘇的時候細胞最好不要分瓶),密度一般為1×104cell/mL為宜。緩慢加入8～10倍體積的含10%胎牛血清[1]、雙抗溶液(濃度一般保持0.1%)的DMEM培養(yǎng)基(含4.0mm L-谷氨酰胺、1000mg/L葡萄糖、110mg丙酮酸鈉經(jīng)0.1μm無菌過濾)進行稀釋,用尖吸管吹打50次將細胞吹散,培養(yǎng)瓶經(jīng)酒精擦拭就可以放入5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。剛復(fù)蘇的細胞比較脆弱在復(fù)蘇的24h內(nèi)最好不要觀察,以免晃動影響細胞貼壁。24h后一般大多數(shù)貼壁細胞已經(jīng)貼壁,這時一定要換成新鮮的培養(yǎng)液,不然凍存液中的DMSO會對細胞造成損傷,在我們的實驗中發(fā)現(xiàn)48h后不除去DMSO會使SMMC-7721細胞喪失原來的細胞形態(tài)變圓從而停止生長。

1.2.2 SMMC-7721細胞的傳代方法 細胞一般鋪滿瓶底80%左右就可以進行傳代了。SMMC-7721細胞形態(tài)一般為花瓣狀,如果細胞數(shù)目過多未及時傳代可以觀察到細胞分為2層:上層為圓形細胞層,下層為花瓣形細胞層。我們實驗室采用的傳代的具體方法如下:先用已過濾的預(yù)冷PBS溶液洗細胞2次,再加入0.25%的胰酶溶液1mL來回輕晃培養(yǎng)瓶用封口膜封口后在顯微鏡下觀察,待大部分細胞變圓后(一般2min左右)立刻豎起培養(yǎng)瓶使細胞脫離胰酶溶液,經(jīng)酒精擦拭拿回超凈臺,用尖吸管將胰酶吸出(此時盡量不要直接倒掉胰酶因為細胞經(jīng)消化已經(jīng)貼壁不牢了,直接倒掉會損失一部分細胞)。最后根據(jù)你要傳的瓶數(shù)加入相應(yīng)的培養(yǎng)基用尖吸管吸取培養(yǎng)基從培養(yǎng)瓶爬滿細胞的那面由上往下吹打。我們一般采取1∶3的傳代方式,細胞生長良好,3d后長滿瓶底。

1.2.3 SMMC-7721細胞的凍存方法 在細胞生長良好的時期一般為對數(shù)生長期我們要對細胞進行凍存,如果實驗中出現(xiàn)污染可以提供健康的細胞來源。下面來談?wù)剝龃娴姆椒?凍存前首先我們要配置凍存液,我們采用的凍存液的比例是1mL的凍存液中含0.5mL的血清、0.4mL的新鮮培養(yǎng)基、0.1mL的DMSO。剛配制的凍存液不能直接加入細胞內(nèi),因為DMSO會釋放出大量的熱會對細胞產(chǎn)生損傷。具體方法如下:將生長良好的SMMC-7721細胞(約為80%～90%致密度,濃度為1×105cell/mL)先用PBS溶液洗2次,用0.25%的胰酶如前面所述的方法將細胞從瓶壁上消化下來移入離心管中800轉(zhuǎn)離心5min,用尖吸管吸去上清,加入已配置好的凍存液,最后將細胞吹散移入凍存管中封口、標(biāo)記好細胞的種類及凍存日期,先放入4℃冰箱10min再轉(zhuǎn)入-20℃30min,然后放入-80℃冰箱過夜,最后取出放入液氮槽中長期貯存。如果實驗室沒有液氮罐,可以在4℃冰箱放30min轉(zhuǎn)入-20℃2h最后放入-80℃冰箱,這樣貯存方法可以貯存半年左右。凍存后的細胞經(jīng)過一段時間可以拿出來復(fù)蘇一瓶,觀察細胞的生長情況。

2 討論

2.1 復(fù)蘇是否采用離心的方法

有些文獻[2]報道細胞復(fù)蘇時采用用離心的方法去掉凍存液,鑒于剛復(fù)蘇的細胞很脆弱離心會對細胞產(chǎn)生一定的損傷,故認為復(fù)蘇時不離心,第2天換液為佳,因為10%的DMSO短期并不會對細胞造成影響,經(jīng)此方法復(fù)蘇的SMMC-7721細胞存活率較高一般達80%以上。

2.2 消化方法的改進

消化時如果單純用胰酶消化時間很難把握,若消化過度,細胞不容易貼壁,48h后仍不貼壁示為死細胞。若消化不完全用尖吸管吹打細胞很難吹下細胞。長時間吹打也會對細胞造成損傷,這樣傳代還會引起每瓶細胞數(shù)目不均一,用PBS洗后消化時間易于掌握,提高細胞的活力。

2.3 凍存液的配制方法改進

以往相關(guān)資料中[3]報道凍存液里含90%的培養(yǎng)液(含血清20%)和10%的DMSO,由于細胞凍存會使細胞變的脆弱活力下降,應(yīng)當(dāng)加大血清的含量以保證復(fù)蘇后的細胞活力較好,復(fù)蘇的成功率較高,目前也有學(xué)者采用90%的血清加10%的DMSO配成凍存液認為這樣供給細胞更多的營養(yǎng)會更利于復(fù)蘇后細胞的成活。

2.4 復(fù)蘇后細胞不貼壁的原因分析

復(fù)蘇后的貼壁細胞24h后80%以上的細胞都會貼壁,不貼壁的細胞可能已經(jīng)死亡,主要有以下3方面的原因:(1)凍存前的細胞已經(jīng)存在污染;(2)凍存方法不正確主要可能是加入血清過少或者凍存溫度時間錯誤;(3)細胞復(fù)蘇時離心時間過長轉(zhuǎn)速過高或細胞貼壁后未及時去除凍存液從而對細胞造成損傷。

一般SMMC-7721細胞在復(fù)蘇后4d左右貼壁率達90﹪以上,就可進行傳代,傳代后的細胞生長較迅速,3d左右基本可以鋪滿瓶底,經(jīng)過2、3次傳代細胞穩(wěn)定后,生長狀態(tài)良好時就可以對細胞進行臨床毒理性試驗研究、細胞核型分析、及提取總蛋白進行蛋白印記分析等各種操作。

3 總結(jié)

在人肝癌SMMC-7721細胞培養(yǎng)過程中最為關(guān)鍵的技術(shù)還是無菌操作,一切的步驟都建立在其基礎(chǔ)之上。對培養(yǎng)過程中所接觸的試劑、液體、器皿、均要進行嚴格的消毒,無菌觀念要貫穿整個實驗的始終,不可松懈。

[1]張卓然.實用細胞培養(yǎng)技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1999:11～27.

[2]唐孟萱,周萬軍,胡元佳,等.HepG2細胞培養(yǎng)方法與條件的探索[J].實用預(yù)防醫(yī)學(xué),2005,12(1):71～73.

[3]李燕,張鍵,于江天.細胞與分子生物學(xué)常用實驗技術(shù)[M].西安:第四軍醫(yī)大學(xué)出版社,2009:7.