陳飛雄申林娜蒲 軍徐 蔚

（1 昆明醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，云南 昆明 650101；2 昆明醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內科，云南 昆明 650101）

線粒體DNA編碼蛋白質亞基的研究

陳飛雄1申林娜2蒲 軍1徐 蔚1

（1 昆明醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，云南 昆明 650101；2 昆明醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內科，云南 昆明 650101）

人類線粒體DNA（mtDNA）是全長為16569 bp的雙鏈閉環(huán)分子，除負責編碼2種rRNA和22種tRNA外，還參與了4種呼吸酶復合物（13種多肽）的形成。包括NADH-CoQ還原酶（NADH-CoQ reductase，ND）中的7個亞基（ND1-6，4L）；泛醌-細胞色素C還原酶（CoQ-Cytc reductase）的1個亞基（Cyt-b）；細胞色素C氧化酶（cytochrome Coxidase,COX）中的3個亞基（COX I–III）；ATP合成酶（ATPase）中的2個亞基（ATPase6，8）。本文就人線粒體DNA編碼的各蛋白亞基的結構、功能和研究進展進行綜述。

線粒體基因組；線粒體；NADH-CoQ還原酶；泛醌-細胞色素C還原酶；細胞色素C氧化酶；ATP合成酶

線粒體是一種普遍存在于真核細胞中的細胞器，除了紅細胞外人類所有體細胞都含有線粒體，其中多數(shù)細胞含有數(shù)以萬計的線粒體。線粒體是真核生物細胞內的能量轉換體系和供能中心，它含有自己的DNA。就人體來說，線粒體內的DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是核外惟一具有自己的遺傳密碼和蛋白質翻譯系統(tǒng)，控制著線粒體一些基本性質。因此，線粒體除了能量轉換作用，還參與了4種呼吸酶復合物（13種多肽）的形成。包括NADH-CoQ還原酶（NADH CoQ reductase，ND）、泛醌-細胞色素C還原酶（CoQ-Cytc reductase）、細胞色素C氧化酶（cytochrome Coxidase，COX）和ATP合成酶（ATPase）[1,2]。

1 線粒體基因組的構成

人類每個mtDNA約有10個基因拷貝，每個細胞包含103～104個線粒體。mtDNA是存在于線粒體內的雙鏈閉環(huán)分子，由16569bp組成，雙鏈中一條為重鏈（H），一條為輕鏈（L）。這是根據(jù)它們的基因產物在CsCl中的密度的不同而區(qū)分的，兩條鏈均具有編碼功能。它除了有DNA外，還有自己的蛋白質合成系統(tǒng)，因為它有22個tRNA基因和2個rRNA基因以及核糖體等。mtDNA蛋白質編碼基因的12/13是由mtDNA的重鏈轉錄的，所編碼的13個蛋白質為：細胞色素氧化酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亞基，NADH脫氫酶的ND1-6和ND4L亞基，細胞色素b以及ATP酶6、8亞基[2]。其復制和轉錄的起始點位于D-loop區(qū)（16028～577np）。mtDNA轉錄與nDNA不同步，其64個密碼子中有4個與核基因組不同[3,4]。在mtDNA，除了一小段D環(huán)區(qū)域外，其他序列無內含子，因此任何mtDNA的突變都會影響到其基因組內的重要功能區(qū)域，從而影響線粒體功能。

2 mtDNA編碼的蛋白質亞基的結構與功能

2.1 mtDNA編碼ATP合酶亞基

mtDNA編碼ATP合酶亞基的是F0亞基中的ATPase6和ATPase8。ATPase6基因存在于所有生物中，但是細菌、植物的線粒體基因組不包含ATPase8基因，這與一般后生動物有所不同。在人的線粒體基因中，ATPase6和ATPase8 2個基因相鄰并重疊45bp，ATPase8基因長207bp，編碼68個氨基酸；ATPase6基因長681bp，編碼226個氨基酸[5-8]。

mtDNA ATPase8和ATPase6是調控能量合成的重要基因，mtDNA ATPase8和ATPase6表達異常會導致線粒體能量合成障礙進而加速細胞凋亡。柏干榮等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在失血性休克腸上皮細胞mtDNA的ATPase6基因測序研究中發(fā)現(xiàn)缺血缺氧時存在堿基突變及編碼氨基酸的改變，進而影響F1F0-ATPase蛋白的功能和ATP的合成。李瑋等[6]通過研究發(fā)現(xiàn)腦出血后血腫周圍水腫組織線粒體ATPase-6基因表達開始下降，至第7d時ATPase6基因表達明顯下降，這一結果提示腦出血可有足夠能量供應促使細胞發(fā)生凋亡。張瑩等[7]研究發(fā)現(xiàn)，長時間的缺血缺氧使mtDNA的ATPase6、ATPase8編碼基因改變，繼之其轉錄下調，導致細胞氧化磷酸化缺陷并加速細胞凋亡的發(fā)生。ATPase6基因位于8993位點的核酸突變會引起神經(jīng)病學性肌無力、運動失調和色素性視網(wǎng)膜炎綜合[8]。洪燈等[9,10]通過研究成功構建了pG-PH1/GFP/ Neomouse-shATP8 RNA干擾質粒，為下一步進行ATP ase8基因RNA干擾在卵母細胞發(fā)育成熟中的作用奠定基礎。并用RT-PCR檢測GV期單個卵母細胞中ATPase8基因的表達，發(fā)現(xiàn)小鼠GV期卵母細胞特異表達的ATPase8基因可能與卵母細胞的正常發(fā)育成熟相關。

2.2 mtDNA編碼的細胞色素氧化酶亞基

COXⅠ亞基、COXⅡ亞基、COXⅢ亞基由mtDNA編碼。其中COXⅠ亞基基因總長約1542bp，編碼513個氨基酸，與血紅素a1、血紅素a3和CuB結合；COXⅡ亞基基因總長約684bp，編碼227個氨基酸，與CuA結合，位于線粒體胞質面與細胞色素C進行反應[11]；COXⅢ亞基基因總長約781bp，編碼260個氨基酸，參與氧化還原連接的質子易位過程，起調節(jié)作用。COXⅠ為mtDNA編碼的3個亞基中最大的一個，與COXⅡ一起構成細胞色素氧化酶的活性中心[12]。

在不同的組織線粒體COX的活性存在著很大差異，按活性大小排列依次是心臟、肝、腎和腦組織等。近年來有報道，心臟和腦缺血缺氧后會表現(xiàn)相應區(qū)域COX活性下降，COX表達改變。Abe等[13]報道，在短暫缺血最敏感的CAl區(qū)缺血3min后再灌，沙鼠該區(qū)的COX在3h出現(xiàn)下降，8h時更明顯，且進行性加重。提示C0X活性的下降可能是細胞能量代謝障礙的重要原因。顧衛(wèi)東等[14]研究發(fā)現(xiàn)，低溫可通過保護C0X活性減輕腦缺血/再灌注期間的細胞能量代謝障礙，從而減少延遲性神經(jīng)元死亡（DND）。

Wang等[15]認為，正常細胞mtDNA的轉錄水平降低、細胞凋亡增高，使得細胞程序性死亡，而mtRNA的增高可降低細胞凋亡，可能與細胞的癌變有關。并且Lu等[16]指出不同的腫瘤可能出現(xiàn)mtDNA不同的基因表達的改變。Parrella等[17]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者COXⅡ的表達比正常組織明顯增高。韓波等[18]應用RT- PCR方法發(fā)現(xiàn)胃癌組織線粒體COXⅠ和ND4的轉錄水平顯著高于遠癌正常胃黏膜組織。癌變組織線粒體COXⅠ和COXⅡ的增高可能是腫瘤細胞為滿足自身能量需求的一種適應性反應，線粒體可能通過凋亡途徑參與腫瘤形成的過程。

高靜等[19]研究發(fā)現(xiàn)COXⅢ在癲癇急性期表達顯著升高，靜止期降至對照水平，而慢性期則顯著降低。說明急性癇性發(fā)作誘發(fā)該亞單位的重新合成，而慢性期長期自發(fā)性孤立的發(fā)作則不足以誘導該亞單位的重新合成，反而破壞其合成機制；并發(fā)現(xiàn)COXⅢ基因和蛋白的改變與海馬神經(jīng)元丟失所導致的線粒體含量下降是無關的，可能的機制是活性氧簇機制。

2.3 mtDNA編碼的泛醌-細胞色素C還原酶亞基

細胞色素b（Cyt-b）是mtDNA編碼的蛋白質。Cyt-b是一個橫貫膜兩側的極端疏水性的蛋白，并與內膜結合，含兩個血紅素b562/bH和b566/bL。Cyt-b基因序列全長為1135bp，編碼378 個氨基酸和一個終止密碼子。 對Cyt-b氨基酸組成和結構基因的DNA順序研究指出，約68%的氨基酸為非極性的。對Cyt-b在電子傳遞鏈中的復雜功能至今還不清楚。

研究家兔在單純皰疹病毒感染的潛伏期神經(jīng)系統(tǒng)中基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)Cyt-b的編碼基因下調表達[20]。Cyt-b在甲狀腺乳頭狀癌細胞中呈高表達[21]。郭麗君等[22]用PCR法擴增、熒光DNA測序，發(fā)現(xiàn)糖尿病組線粒體Cyt-b基因持有多數(shù)的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）是有害的。張默函等[23]研究發(fā)現(xiàn)mtDNA Cyt-b的mRNA表達水平在乳腺癌組織較癌旁組織高，mtDNA Cyt-b基因在乳腺癌組織中轉錄水平的上調，可能是腫瘤細胞為滿足自身能量需求的一種適應性反應，但是具體機制尚不清楚，尚有待進一步研究。

由于Cyt-b基因在線粒體基因組中進化速度適中，而且在一定的進化尺度內Cyt-b基因不受飽和效應的嚴重影響，所提供的系統(tǒng)發(fā)育信息和遺傳分化水平適于分析種間和屬間差異。所以Cyt-b成為研究種內或近緣種間系統(tǒng)發(fā)育和遺傳問題最常用的工具之一，它的部分或全序列被廣泛應用于動物類群的系統(tǒng)進化和分類研究中。付小全等[24]發(fā)現(xiàn)萍鄉(xiāng)肉紅鯽與其他鯽魚類的Cyt-b基因具有較高的同源性，與普通鯽魚的相似性為98%，萍鄉(xiāng)肉紅鯽與普通鯽魚親緣關系最近。

2.4 mtDNA編碼的NADH還原酶亞基

NADH還原酶疏水部分的7個亞基ND1-ND6和ND4L由mtDNA編碼[25]。在人的線粒體基因中，ND1基因長957bp，編碼318個氨基酸；ND2基因長1042bp，編碼347個氨基酸；ND3基因長346bp，編碼115個氨基酸；ND4基因長1378bp，編碼459個氨基酸；ND4L基因長297bp，編碼98個氨基酸；ND5基因長1812bp，編碼603個氨基酸；ND6基因長525bp，編碼174個氨基酸；其中ND4和ND4L 2個基因相鄰并重疊6bp。

李傳連等[26]對弱精子癥（AST）精子mtDNA ND3、ND4L基因突變檢測和分析時發(fā)現(xiàn)線粒體單體型與精子活力可能存在一定的相關性；mtDNA 10398G-10400T多態(tài)性可能是精子活力的有益因素，mtDNA G10310A突變可能是精子活力的有害因素。李明珍等[27]研究發(fā)現(xiàn)線粒體基因ND4 12026A→G突變攜帶者的家系臨床表現(xiàn)多樣，并可能與自身免疫相關。魏佳等[28]通過直接測序檢測乳腺癌、良性乳腺腫瘤散發(fā)病例外周血和乳腺組織中線粒體ND5基因變異，發(fā)現(xiàn)乳腺癌與良性乳腺腫瘤相比線粒體ND5基因更多的發(fā)生對線粒體功能產生影響的惡性突變，線粒體ND5基因突變與乳腺腫瘤發(fā)生發(fā)展可能存在一定相關，這種區(qū)別可能成為潛在的腫瘤診斷分子標記。李東等[29]發(fā)現(xiàn)mtDNA3394T→C突變與老年線粒體糖尿病的發(fā)生與發(fā)展有關，并起著重要作用。

3 展 望

近年來，隨著分子生物學、基因工程、克隆技術等技術手段的發(fā)展與完善，mtDNA結構與功能的研究在分子進化、生物分類、群體遺傳結構分析、親緣關系鑒定、法醫(yī)學鑒定、衰老、疾病診斷、細胞凋亡和氧化磷酸化作用機制等領域已經(jīng)取得了令人矚目的成就。在動物重要經(jīng)濟性狀的研究方面，比如在牛的肥育性狀、產奶量、乳脂率、乳蛋白含量、繁殖性狀等方面也已經(jīng)取得顯著的成績。在人類疾病研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的由mtDNA變異導致的疾病已達70多種，其中包括Parkinson綜合征、Alzheimer綜合征、Leber氏視神經(jīng)?。↙HON）、老年癡呆與舞蹈綜合征（DEMCHO）、耳聾（DMDF）、癲癇（MERRF）等，因此，深入這一領域的研究，對于明確某些疾病的發(fā)病機制，尋找新的治療藥物和治療途徑及提高動物重要經(jīng)濟性狀等方面均有重要的意義。

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The Research Progress of Protein Subunits Coded by The Mitochondrial DNA

CHEN Fei-xiong1, SHEN Lin-na2, PU Jun1, XU Wei1
(1 Department of Neurosurgery, The 2nd of Af fi liated Hospital of Kunming Medical University, Kunming, Yunnan 650101,China;2 Department of Neurology, The 2nd of Af fi liated Hospital of Kunming Medical University, Kunming, Yunnan 650101,China)

The total length of the human mitochondrial DNA(double loop molecular chain)was 16,569 bp, the genome content of human including 2 rRNA,22 tRNA, and 13 protein-coding genes.The 13 protein-coding genes were NADH dehydrogenase subunits 1-6 and 4L genes; cytochrome c oxidase subunits I-III genes; cytochrome b gene; ATPase subunits 6 and 8 genes; In the present review ,the composition, the structure and function, the most signi fi cant studies on the 13 protein-coding genes are reported.

Mitochondrial genome; Mitochondria; NADH-CoQ reductase; CoQ-Cytc reductase; Cytochrome Coxidase; ATPase

Q5

A

1671-8194（2011）01-0006-03

云南省自然科學基金重點項目（2003C0010Z）