溫中華 朱 海 戴小宇 張曉冬*

（1 第二軍醫(yī)大學(xué)生物技術(shù)系，上海 200433；2 第二軍醫(yī)大學(xué)藥物安全性評價中心，上海 200433）

人血白蛋白（Human serum albumin，HSA）是人體血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，約占到血漿蛋白總量的60%。HSA能維持血液動力學(xué)平衡和血管內(nèi)滲透壓，吸收組織中多余液體到血液循環(huán)中，使動脈壓升高，廣泛應(yīng)用于失血創(chuàng)傷燒傷引起的休克，腦水腫及損傷引起的顱壓升高，肝硬化及腎病引起的水腫或腹水，低蛋白血癥的防治和新生兒高膽紅素血癥等。目前臨床使用的HSA制品絕大部分部是從人源血漿中提取純化而得（Plasma-derived HSA，pdHSA），來源有限，價格昂貴，還不能排除病毒（特別是艾滋病病毒和乙肝病毒）或其他潛在致病因子的影響，這都極大限制著HSA的廣泛應(yīng)用。而重組人血白蛋白（Recombinant human serum albumin，rHSA）則可以避免病毒感染，到目前為止，已在大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、植物和轉(zhuǎn)基因動物等系統(tǒng)中進(jìn)行了rHSA的表達(dá)研究，通過基因改造或化學(xué)修飾還能進(jìn)一步擴大rHSA的臨床應(yīng)用范圍，是目前研究的熱點。

1 rHSA與pdHSA的比較

1.1 結(jié)構(gòu)比較

高度純化的rHSA與pdHSA在分子結(jié)構(gòu)上完全一致，是一條66.5-kDa單鏈、非糖基化多肽鏈，由585個氨基酸殘基組成，富含組氨酸和色氨酸，含17對二硫鍵和一個半胱氨酸位點。rHSA的三級結(jié)構(gòu)呈心形，67%為α-螺旋，不含β-折疊，由三個結(jié)構(gòu)域（（I、Ⅱ和Ⅲ）組成，每個結(jié)構(gòu)域又各包含兩個亞結(jié)構(gòu)域。Sadaharu等[1]分析了rHSA的三個結(jié)構(gòu)域與藥物的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)I型區(qū)域與藥物結(jié)合的能力最強，這是由其34位上游離的半胱氨酸殘基所決定的。

1.2 功能比較

rHSA作為pdHSA可能的臨床替代品，具有與pdHSA相似的生理功能。大鼠體內(nèi)靜脈注射用同位素125I標(biāo)記rHSA與pdHSA，發(fā)現(xiàn)二者在組織分布、血液半衰期以及尿液和糞便代謝方面都無顯著差異[2]。一、二、三期臨床試驗結(jié)果表明rHSA具有較好的療效，不良反應(yīng)較小[3]。在結(jié)合和轉(zhuǎn)運內(nèi)外源性物質(zhì)方面，rHSA對藥物如華法林、苯丙香豆素、普拉洛芬、布洛芬等的立體選擇性結(jié)合特性與pdHSA一致[2]。需要注意的是，HSA在用于治療出血性休克、燒傷、白蛋白過少等病癥時，由于在病理條件下毛細(xì)血管對HSA的通透性增加，大量輸入HSA后可能會透過毛細(xì)血管壁而導(dǎo)致器官水腫，肺臟對此尤為敏感，從而使病情加重。通過基因工程手段獲得的rHSA二聚體在保留相應(yīng)的生理功能不變的情況下，既延長了其血漿半衰期，又降低了其毛細(xì)血管通過率，將有可能解決這一問題[4]。

1.3 安全性比較

pdHSA由于其可能含有血源捐贈者自身所攜帶的病毒（如艾滋病病毒、肝炎病毒等）和其他潛在的致病因子，使得患者在使用pdHSA制品時將面臨巨大風(fēng)險。而影響rHSA安全應(yīng)用于臨床的主要潛在危險因素是其所含有的極少量酵母成分，包括蛋白質(zhì)和甘露聚糖等多糖成分，這些成分可能會在重復(fù)注輸時導(dǎo)致急性免疫反應(yīng)，從而危害患者健康。因此，提高rHSA的分離純化技術(shù)，盡可能減少雜質(zhì)含量，將有助于提高rHSA的安全性。

2 rHSA的臨床研究現(xiàn)狀

臨床前研究結(jié)果顯示在分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及免疫學(xué)等方面rHSA與pdHSA相似，針對rHSA安全性和療效的一、二、三期臨床試驗也已在世界許多實驗室和臨床中心相繼開展。

一期臨床實驗主要是對rHSA進(jìn)行初步的臨床藥理學(xué)及人體安全性評價。在日本進(jìn)行的一期臨床實驗中，25名健康志愿者連續(xù)三天靜脈注射rHSA后，檢測的生理指標(biāo)（如血壓、脈搏、體質(zhì)量、心電圖檢測、血液和尿液分析等）未發(fā)現(xiàn)藥物相關(guān)明顯異常，并且在3個月內(nèi)rHSA抗體滴度無顯著升高[3]。英國DELTA公司一期臨床試驗將rHSA與pdHSA在安全性、耐受性、藥理學(xué)以及藥代動力學(xué)等方面做了對比，結(jié)果表明二者在這些方面具有相似性[5]。

二期臨床試驗進(jìn)一步驗證rHSA的有效性和安全性，考察其不良反應(yīng)。對出血性休克、肝硬化和肝腹水患者的治療結(jié)果證實rHSA具有極好的療效，且不良反應(yīng)極小[3]。Kazushi[6]等還研究了rHSA在治療患腎病綜合癥的兒童患者中的效果，6名腎病綜合癥兒童患者在接受連有髓袢利尿劑的rHSA（0.3～0.5 g/kg）的治療后，沒有產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)。

在擴大的多中心臨床試驗中，423名肝硬化患者經(jīng)過間隔2周的三個周期重復(fù)給予rHSA，每個周期持續(xù)3d。結(jié)果顯示血清蛋白水平和膠體滲透壓均顯著升高。423名患者中有96名出現(xiàn)不良反應(yīng)（22.7%），但均沒有嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，而且三個周期之間的不良反應(yīng)發(fā)生率沒有明顯不同[7]。在其他三期臨床試驗中，rHSA在治療如燒傷、腎病綜合癥、出血性休克、急性腹部不適以及直接心臟外科手術(shù)中的高?；颊叩龋捕急憩F(xiàn)出較好的療效。

3 rHSA的研究趨勢

3.1 融合蛋白

許多蛋白類或多肽藥物在血液中清除速率較快，臨床上不得不提高劑量或用藥次數(shù)，以穩(wěn)定療效，在一定程度上增加了藥物的不良反應(yīng)以及患者的醫(yī)藥負(fù)擔(dān)。通過基因重組，將藥物蛋白或多肽的基因與人血白蛋白的基因融合表達(dá)，獲得的融合蛋白不僅可以保留原藥物蛋白生物活性，還提高了穩(wěn)定性，延長其半衰期，并有可能增強其靶向性，提高療效。

粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）是一種分泌型糖蛋白，能有效促進(jìn)粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的分化增生。通過細(xì)菌表達(dá)的重組粒細(xì)胞集落刺激因子（rG-CSF）已經(jīng)應(yīng)用于臨床，如用于治療患腫瘤放療、化療引起的粒細(xì)胞減少癥、再生障礙性貧血等。但由于其半衰期短，為維持最佳療效需要頻繁給藥。通過基因重組，可將rG-CSF的N-末端與rHSA的C-末端連接形成融合蛋白。Halpern等[8]研究了重組人粒細(xì)胞集落刺激因子白蛋白融合蛋白在小鼠和食蟹猴體內(nèi)的藥效學(xué)和藥動學(xué)特點。兩種動物上融合蛋白與非融合型比較半衰期、平均滯留時間和清除率均顯著延長。

Osborn等[9]將人白細(xì)胞介素-2（IL-2）基因與HSA基因融合，表達(dá)獲得融合蛋白Albuleukin。Albuleukin將IL-2的血漿半衰期從19-57min延長到了6-8h，其在促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、受體結(jié)合、和誘導(dǎo)NK細(xì)胞分泌IFN-γ等方面表現(xiàn)出與rIL-2相似的特點。二者都能有效抑制小鼠腎細(xì)胞腺瘤和肝黑色素瘤，并且Albuleukin在預(yù)防轉(zhuǎn)移和改善生存率上比rIL-2更有效。其他的研究還有胸腺素-α1（Tα1）和四苯基卟啉等，融合蛋白均顯示出與原來相似的藥效學(xué)特性[10,11]。

3.2 藥物載體

rHSA另外一個重要醫(yī)學(xué)用途是作為一種新型藥物載體，能有效提高藥物輸送的靶向性和代謝半衰期，這對于不良反應(yīng)大、機體容易產(chǎn)生耐藥性的藥物來說是一個新的選擇。rHSA作為藥物載體有兩種途徑，其一是形成類似脂質(zhì)體的微囊，包裹著藥物運送到體內(nèi)；另一途徑則是通過化學(xué)修飾等方法直接與相應(yīng)藥物連接進(jìn)行運輸。

白蛋白微囊按其直徑大小不同經(jīng)靜脈注射入體內(nèi)后可有效輸送到肺部或肝臟。15～30 um或更大直徑的微球體可在流經(jīng)心臟后99%沉積于肺部的毛細(xì)血管床；而1～3um大小的微球體則可以通過網(wǎng)狀內(nèi)皮組織90%沉積在肝臟。因此白蛋白微球體可用作藥物載體進(jìn)行靶向輸送，以減少用藥劑量，減輕不良反應(yīng)[3]。

rHSA通過化學(xué)修飾或基因改造后，還可獲得與特定細(xì)胞表面受體相結(jié)合的配體基團，從而進(jìn)行體內(nèi)靶向輸送。糖蛋白很容易識別相應(yīng)細(xì)胞受體，經(jīng)甘露糖修飾后的人血清白蛋白能有效識別肝臟Kupffer細(xì)胞表面甘露糖受體。Kenshiro等[12]成功設(shè)計并通過基因工程手段表達(dá)出甘露糖化重組人血清白蛋白的三聚體（TM-rHSA），TM-rHSA能識別肝臟非實質(zhì)細(xì)胞上的甘露糖受體，從而被選擇性的運送到肝臟。Masaaki等[13]在室溫下通過二硫鍵的斷裂使rHSA部分變性進(jìn)而連接成水凝膠體，并對水凝膠與苯甲酸鈉、水楊酸和華法林等藥物的結(jié)合和釋放能力進(jìn)行了實驗，發(fā)現(xiàn)水凝膠化后的rHSA仍保留有對藥物的結(jié)合能力。其將苯甲酸鈉和水楊酸完全釋放需要2h，而華法林則持續(xù)約24h。這表明rHSA水凝膠具有持續(xù)穩(wěn)定釋放藥物的能力，可作為一種新型藥物控釋載體。

將抗腫瘤化療藥物與血蛋白相結(jié)合是目前研究的熱點，紫杉醇白蛋白納米混懸液于2008年6月在我國批準(zhǔn)上市，臨床上已得到了廣泛的應(yīng)用。Naohisa等[14]研究發(fā)現(xiàn)，對于將LY-80移植到大鼠右肢形成的腫瘤，直接進(jìn)行腫瘤注射硫基一氧化氮-重組人血白蛋白（S-nitrosylated human serum albumin，SNO-HSA），腫瘤生長受到明顯抑制。

用rHSA輸送藥物的一個重要好處是能有效提高機體對相應(yīng)藥物的耐受性，即便是對于機體已經(jīng)產(chǎn)生耐受的藥物，將其與rHSA聯(lián)合后在再次輸入體內(nèi)時，仍然可能具有一定療效。例如在臨床上有些腎病綜合癥患者由于對利尿劑產(chǎn)生耐受而進(jìn)一步發(fā)展成嚴(yán)重水腫、胸腔積液和腹水時，對其注射已結(jié)合了髓袢利尿劑的rHSA將會產(chǎn)生較好的療效[15]。

4 展 望

應(yīng)用現(xiàn)代基因工程技術(shù)獲得高純度的rHSA在結(jié)構(gòu)、功能和免疫學(xué)性質(zhì)等方面pdHSA基本相似，有望成為pdHSA替代產(chǎn)品，日本田ā三菱制藥株式會社研制的基因重組人血白蛋白于2008年全球首次上市，用于治療由于燒傷、肝硬化等引起的白蛋白嚴(yán)重丟失等癥。但由于其在臨床中使用劑量大，極其微量的百分比不純物質(zhì)，在單一劑量中就是微克甚至毫克級的，所以要求的純度要更高，因此對rHSA的研究提出了更高的要求，在安全性、功能，以及患者對其認(rèn)知接受程度上還有許多工作要做。而通過基因工程手段獲得rHSA與其他重要蛋白的融合蛋白，或經(jīng)化學(xué)修飾與藥物結(jié)合，使之成為重要的藥物運送載體也是其未來發(fā)展的重要方面。

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