劉 釗，趙 鵬，楊占秋

(1中南民族大學(xué)藥學(xué)院，武漢430074;2武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)病毒學(xué)研究所，武漢430071)

柯薩奇病毒(Coxsackie virus)屬小核糖核酸科腸道病毒屬［1］，病原體柯薩奇病毒據(jù)其生物學(xué)特點(diǎn)分為A和B兩類，A組病毒有24個(gè)血清型，即A1-A24;B組病毒有6個(gè)血清型即B1-B6.柯薩奇病毒可引起腦膜炎和輕度麻痹、胸膜痛、肋間痛、呼吸性疾病、結(jié)膜炎以及手足口綜合征［2，3］.近幾年，國內(nèi)外研究學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型糖尿病的發(fā)病與病毒感染有很大關(guān)系，柯薩奇病毒尤其是柯薩奇 B4病毒(CVB4)在Ⅰ型糖尿病中起重要作用［4，5］.最近研究發(fā)現(xiàn)，CVB4的非結(jié)構(gòu)蛋白P2C與人胰島素表面的谷氨酸脫羧酶(GAD)具有同源序列，且CVB4無論在體內(nèi)還是在體外均可侵犯人胰島B細(xì)胞，導(dǎo)致其合成胰島素功能受損［6］.

目前在臨床上缺乏有效的抗CVB4特異性的治療藥物和預(yù)防方法，且西藥普遍存在價(jià)格昂貴、副作用大、療效質(zhì)疑等缺點(diǎn).板藍(lán)根是十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort的干燥根，是公認(rèn)的有較好的抗病毒效果的中藥之一，具有清熱解毒、涼血利咽之功效.《本草綱目》記載:板藍(lán)根主治“時(shí)口瘡，熱病發(fā)斑，熱毒下痢，喉痹、丹毒……”.傳統(tǒng)醫(yī)藥和現(xiàn)代藥理研究表明，板藍(lán)根的抗病毒活性肯定，對流感病毒的防治效果更佳［7］.此外它對肝炎病毒(HBV及HAV)、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腮腺炎病毒、乙型腦炎病毒、腎病出液病毒(HFRSV)、單皰病毒(HSV-2)、柯薩奇病毒(CVB3)均有明顯的防治作用.本文研究了中藥復(fù)方板藍(lán)根顆粒體外抗CVB4的作用機(jī)理，擬為開發(fā)和利用其廣譜抗病毒活性提供一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 原料與試劑

1.1.1 藥物

復(fù)方板藍(lán)根顆粒由太極集團(tuán)重慶中藥二廠有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字Z50020623，配制成終濃度為80 mg/mL，使用前于 0.04 ～0.06 MPa下滅菌 15 min，冷卻后密封置于4℃冰箱中冷藏備用.

1.1.2 細(xì)胞

Hep-2(鼻咽癌)細(xì)胞為武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)病毒研究所保存.細(xì)胞生長液為含10%新生牛血清的DMEM，細(xì)胞維持液為含2%新生牛血清的DMEM，常規(guī)加入青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL.

1.1.3 病毒

CVB4于－80℃武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)病毒學(xué)研究所保存，實(shí)驗(yàn)前復(fù)蘇.病毒在Hep-2細(xì)胞中活化增殖后，采用Reed-Muench微量法滴定其滴度為10－4.713 TCID50/mL，實(shí)驗(yàn)用100 TCID50/mL.

1.1.4 試劑

DMEM為GIBCO公司生產(chǎn)和 MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)為Hyclone公司產(chǎn)品.MTT以不含血清的MEM培養(yǎng)基配制成5 g/L溶液，過濾除菌后置4℃冰箱保存?zhèn)溆?二甲基亞砜(DMSO)由上海菲達(dá)有限公司提供.新生小牛血清購自三利公司.

1.1.5 主要儀器

Forma Scientific超凈工作臺(tái)，美國制造.TGL-16C型高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亨科學(xué)儀器廠生產(chǎn).OLYMPUS IMT-413型倒置顯微鏡，日本制造.DG3022-A型酶聯(lián)免疫檢測儀，第四軍醫(yī)大學(xué)、國營華東電子管廠聯(lián)合研制.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥物對細(xì)胞毒性的測定

用胰酶將生長良好的Hep-2細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，按1×106個(gè)/mL濃度分種于96孔板，每孔0.1 mL.置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).24 h后棄培養(yǎng)液上清，換含不同濃度的含藥維持液，每孔200 μL.藥物的終濃度分別為 125、250、500、1000、2000、4000、640、800、1600 μg/mL.每種濃度重復(fù) 4孔，實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照、病毒對照.繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，以MTT(四甲基偶氮唑鹽法)法(如1.2.2)檢測細(xì)胞存活率.并根據(jù)細(xì)胞存活率，找出藥物對細(xì)胞的最大無毒濃度范圍.

1.2.2 細(xì)胞活性的測定(MTT染色法)

根據(jù)Mosmann建立的MTT法測定細(xì)胞活性.棄培養(yǎng)上清液，每孔加5 mg/mL MTT的不含血清的DMEM 50μL，37℃，5%CO2孵育4～6 h，黃色的MTT被活細(xì)胞的線粒體脫氫酶還原成藍(lán)色的甲簪結(jié)晶，小心吸出 MTT，PBS洗3次，每孔加50μL DMSO終止反應(yīng)，振蕩混勻，在15 min內(nèi)甲簪結(jié)晶被溶解，在波長570 nm下測定吸光度OD值.OD值與活細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān).

1.2.3 藥物對CVB4生物合成的抑制作用的測定

于已長成單層的Hep-2細(xì)胞96孔板上，每孔接種50μL的100 TCID50的CVB4病毒液，于37℃吸附90 min，棄病毒上清液.根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在藥物無毒濃度范圍內(nèi)，加入不同濃度的含藥維持液每孔 0.2 mL，藥物濃度分別為 100、200、400、800、1600μg/mL;同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照、病毒對照、陽性藥物病毒唑?qū)φ?每日觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，約在病毒對照CPE為 +++～++++時(shí)棄培養(yǎng)液上清液，用MTT法檢測病毒抑制率，并計(jì)算藥物對CVB4的病毒抑制率.

1.2.4 藥物抗病毒吸附實(shí)驗(yàn)

分別將不同濃度的板藍(lán)根加至Hep-2單層細(xì)胞孔中，于 37℃作用 6 h，棄上清液，再加 100 TCID50/mL滴度的CVB4100μL/孔，于37℃吸附90min后，棄上清液，加細(xì)胞維持液，37℃、5%CO2培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變.實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照、病毒對照.

1.2.5 藥物直接滅活病毒實(shí)驗(yàn)

將100 TCID50/mL滴度的CVB4與不同濃度的板藍(lán)根4℃作用6 h.反應(yīng)體系為200μL，含100μL的100 TCID50/mL滴度的CVB4和100μL的藥物，并保證藥物的終濃度與藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)相同.然后將混合液接種于單層Hep-2細(xì)胞中，孵育1.5 h后，換用2%DMEM培養(yǎng)液維持細(xì)胞生長，37℃、5%CO2培養(yǎng)，逐日觀察CPE.實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照、病毒對照.

1.2.6 計(jì)算公式和分析方法

CPE記錄方法:“－”表示無CPE;“+”表示有CPE，且“+”、“++”、“+++”、“++++”依次表示25%、50%、75%、100%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE.

(1)結(jié)合細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和藥物抗病毒實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5的Probit回歸法計(jì)算藥物半數(shù)毒性濃度TC50和半數(shù)有效濃度IC50，得到藥物治療指數(shù)(Treatment Index，TI=TC50/IC50).采用治療指數(shù)作為評價(jià)指標(biāo)衡量各藥物對病毒抑制的效力.

(2)采用直線相關(guān)分析，觀察中藥板藍(lán)根不同劑量與細(xì)胞存活率、病毒抑制率等之間是否存在直線關(guān)系，并求出直線回歸方程和相關(guān)系數(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 藥物毒性的效果

中藥板藍(lán)根和病毒唑的不同濃度對細(xì)胞的毒性

圖1 正常Hep-2細(xì)胞Fig.1 Normal Hep-2 cell

由表2可知，在100～1600μg/mL濃度范圍內(nèi)，隨藥物濃度增加，其抗病毒活性增強(qiáng)，病毒抑制率升高.經(jīng)直線回歸分析，藥物濃度與病毒抑制率間有直線關(guān)系，P＜0.01.其直線方程和相關(guān)系數(shù)分別為:y=14.155+0.023x，r=0.883.藥物濃度 ＞ 1600實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1.通過光鏡觀察，板藍(lán)根對Hep-2細(xì)胞毒性作用表現(xiàn)為:細(xì)胞變小，粘連，破碎，脫落，胞漿內(nèi)顆粒增加，折光性增強(qiáng).

表1 復(fù)方板藍(lán)根顆粒對Hep-2細(xì)胞的毒性作用Tab.1 Cytotoxity of the isatis root granula prescription to Hep-2 cells

由表1可知，復(fù)方板藍(lán)根顆粒的TC50＞3000 μg/mL，說明其安全系數(shù)大.藥物在1000～2000μg/mL范圍內(nèi)細(xì)胞存活率約達(dá)50%，從而確定該范圍藥物濃度為抗病毒實(shí)驗(yàn)的最高允許濃度;當(dāng)細(xì)胞經(jīng)較高濃度的藥物作用后，死亡細(xì)胞數(shù)增加，細(xì)胞存活率降低.經(jīng)直線回歸分析，藥物濃度與細(xì)胞存活率之間存在直線關(guān)系，P＜0.01.病毒唑和板藍(lán)根的直線方程和相關(guān)系數(shù)分別為:y=73.119－0.007x，r= －0.887.經(jīng)計(jì)算，板藍(lán)根對Hep-2細(xì)胞的TC50為 3141.93 μg/mL.

2.2 藥物抗病毒生物合成的效果

給藥后24～48 h內(nèi)，鏡下觀察細(xì)胞病變，發(fā)現(xiàn)病毒對照孔出現(xiàn)明顯的CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、變圓、脫落、碎裂，胞漿內(nèi)顆粒增多，折光性增強(qiáng)(見圖1和圖2).試驗(yàn)孔與病毒對照孔有明顯的差別，試驗(yàn)孔存活細(xì)胞多于病毒對照孔，用MTT法按公式計(jì)算板藍(lán)根對CVB4的抑制率，結(jié)果見表2.μg/mL時(shí)，對CVB4細(xì)胞病變抑制程度高于50%，表現(xiàn)較強(qiáng)的抗病毒活性，說明復(fù)方板藍(lán)根顆粒能明顯抑制CVB4在Hep-2細(xì)胞內(nèi)的生物合成.

圖2 Hep-2細(xì)胞感染CVB4所致CPEFig.2 Cytopathic effect of Hep-2 cell infected by CVB4

2.3 藥物抗病毒吸附的效果

給藥后24～48 h內(nèi)，鏡下觀察細(xì)胞病變，發(fā)現(xiàn)病毒對照孔出現(xiàn)明顯的CPE，而各給藥的不同濃度的試驗(yàn)孔與病毒對照孔均有明顯多于病毒對照孔的存活細(xì)胞，用MTT法按公式計(jì)算板藍(lán)根對CVB4的抑制率，結(jié)果見表3.

表2 復(fù)方板藍(lán)根顆粒的抗CVB4生物合成作用Tab.2 Anti-CVB4 biological synthesis＇s effect of the Isatis Root granula prescription in vitro

表3 復(fù)方板藍(lán)根顆粒的抗CVB4吸附細(xì)胞作用Tab.3 Anti-CVB4's adsorption to Hep-2 cells of the Isatis Root granula prescription in vitro

由表3可知，在100～1600μg/mL濃度范圍內(nèi)，隨藥物濃度增加，其抗病毒活性增強(qiáng)，病毒抑制率升高.經(jīng)直線回歸分析，藥物濃度與病毒抑制率間有直線關(guān)系，P＜0.01.其直線方程和相關(guān)系數(shù)分別為:y=14.155+0.023x，r=0.966.藥物濃度 ＞ 1600 μg/mL時(shí)，對 CVB4細(xì)胞病變抑制程度可達(dá)近50%，表現(xiàn)較強(qiáng)的抗病毒活性，說明復(fù)方板藍(lán)根顆粒能明顯阻止病毒吸附細(xì)胞，從而預(yù)防CVB4對Hep-2細(xì)胞的感染.經(jīng)方差分析，藥物抗病毒生物合成與抗病毒吸附的 IC50相比，F(xiàn)=7.153，P=0.056，P＞0.05，無明顯差別.兩者的治療指數(shù) TI值均為2.78，無差別.說明板藍(lán)根在抗CVB4吸附細(xì)胞和在細(xì)胞內(nèi)的生物合成上同效.

2.4 藥物直接滅活病毒的效果

按實(shí)驗(yàn)方法將藥物與病毒混合后再作用于細(xì)胞，逐日觀察細(xì)胞病變.發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根不同濃度組均出現(xiàn)典型CVB4感染所致的CPE，且與病毒對照孔無顯著區(qū)別，說明板藍(lán)根不能直接殺滅CVB4.

3 結(jié)論

中藥復(fù)方板藍(lán)根顆粒具有體外抗CVB4的作用，其作用是通過阻止CVB4的吸附作用和抑制CVB4在Hep-2細(xì)胞內(nèi)生物合成而發(fā)揮，其對CVB4無直接滅活作用.

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