王海英，牟曉慶

(中南民族大學(xué)微生物與生物轉(zhuǎn)化重點實驗室，武漢430074)

大量的研究表明，藻類對生活污水、食品加工污水、畜禽場污水、工農(nóng)業(yè)混合污水以及工業(yè)污水中的氮、磷等營養(yǎng)物的去除作用和效果均十分顯著.利用污水培養(yǎng)微藻能有效地去除造成水體富營養(yǎng)化和其它污染的營養(yǎng)物質(zhì)，并且處理污水具有成本低、能耗少、效率高、收益大等特點［1，2］，是一項非常有潛力的生態(tài)環(huán)保技術(shù).

藻類因其光合作用效率高、環(huán)境適應(yīng)能力強、生長周期短、生物產(chǎn)量高的特點而成為國內(nèi)外公認的生產(chǎn)生物質(zhì)能源的理想原料［3］.但此類原料的大規(guī)模生產(chǎn)系統(tǒng)存在幾個技術(shù)難題:1)維持微藻種類的穩(wěn)定相當困難;2)微藻生物質(zhì)生產(chǎn)力過低;3)微藻生物質(zhì)生產(chǎn)成本仍顯著高于產(chǎn)業(yè)化可接受水平［4］.

將微藻生產(chǎn)油脂與處理城市污水相結(jié)合，可以創(chuàng)造額外經(jīng)濟效益和生態(tài)效益，以此彌補微藻生產(chǎn)油脂成本過高的不足，從而提供顯著的環(huán)境效益并提高生物燃料技術(shù)的經(jīng)濟可行性，可以發(fā)展出可再生能源生產(chǎn)和減排的雙效模式.

本文對城市污水進行高壓和紫外2種方式滅菌后培養(yǎng)了一株油脂含量較高的蛋白核小球藻，評價該藻對污水的凈化效果，測定其生物量和油脂產(chǎn)量，對城市污水培養(yǎng)蛋白核小球藻生產(chǎn)油脂的可能性進行初試探索，建立起以微藻處理城市污水為基礎(chǔ)的可再生能源新技術(shù)路線.

1 材料與方法

1.1 微藻和培養(yǎng)基

蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidsa)來自中南民族大學(xué)發(fā)酵實驗室，城市污水取自中南民族大學(xué)南湖排污口.藻種的活化及通氣擴大培養(yǎng)活化采用SE 培養(yǎng)基(g/L):NaNO30.25、K2HPO4·3H2O 0.075、MgSO4·7H2O 0.075、CaCl2·2H2O 0.025、KH2PO40.175、NaCl 0.025、FeCl3·6H2O 0.005;Fe-EDTA 1 mL、A5;微量元素液1 mL、土壤提取液1 mL.微量元素混合物配方(g/L):H3BO32.86、MnCl2·4H2O 1.81、ZnSO4·7H2O 0.222、Na2MoO4·2H2O 0.39、CuSO4·5H2O 0.079、Co(NO3)2·6H2O 0.0494，40 mL/L的土壤水提上清液.城市污水取自中南民族大學(xué)南湖排污口，培養(yǎng)時在污水中加入1.0 mL/L微量元素混合物作為微藻培養(yǎng)基.

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白核小球藻的培養(yǎng)

污水培養(yǎng)基的滅菌分為高壓滅菌和紫外滅菌.其中高壓滅菌:120℃滅菌20 min;紫外滅菌:距離燈管10 cm照射20 min.在25℃，光照強度約為3500 lux通空氣培養(yǎng)，于3 L的三角瓶中培養(yǎng)，裝城市污水培養(yǎng)基2.5 L/瓶，無菌空氣由空氣泵通過硅膠管連接的空氣過濾器引入，流速300 mL/min，藻種接種量為培養(yǎng)基的10%，培養(yǎng)溫度為28±2(℃)，光照強度為4500 lux，連續(xù)光照.

1.2.2 檢測方法

藻干重的測定:采用離心法收集藻細胞，培養(yǎng)中止后，經(jīng)4000 r/min離心10min，用蒸餾水洗滌藻細胞，重復(fù)離心，將收獲的濕藻細胞干燥，獲得藻粉稱重.藻油脂含量的測定采用氯仿甲醇抽提油脂［5］.污水中氨氮、總氮、總磷的測定水相同于污水檢測中所述方法分析［6］.污水中氨氮、總氮、總磷去除率的計算:去除率=(原始含量－殘留量)/原始含量×100%.

小球藻脂肪酸成分及含量的測定［7］:取30 mg凍干藻粉，放入帶螺帽的水解管內(nèi)，加2 mL CHCl3-CH3OH混合液(體積比為2∶1)，充N21 min后密閉封口，超聲萃取3 min(33 kHz，300 W)，移出上層清液，重復(fù)3次，合并萃取液，移入具塞試管，N2濃縮吹干，加入0.3mL正十七酸內(nèi)標液(0.4 g/L)，N2濃縮吹干.加1 mL 0.5 mol/L的KOH-CH3OH溶液，充氮密封，迅速混勻，于70℃水浴中皂化15 min，冷卻至室溫后加入三氟化硼1 mL，充氮密封，振蕩1 min，于70℃水浴甲酯化30 min，冷卻至室溫，準確加入正己烷2.0 mL，振蕩再加入2.0 mL飽和NaCl溶液，振蕩，靜置，將上層清液取出，準備進樣.所有操作須在低光照和氮氣保護下進行.使用Agilent6890N氣相色譜儀，毛細管色譜柱HP-5(30 m ×320 μm ×0.25μm，5%PhenylSiloxane)進行分析.進樣口溫度為250℃，氫火焰離子化檢測器(FID)溫度為300℃，載氣為高純N2，恒流控制，N2流量1.0 mL/min，分流比為30∶1;空氣流量400 mL/min，H2流量 30 mL/min;進樣量 3 μL.柱溫程序升溫:第1段柱溫為150℃，升溫速率為10℃/min，至210℃;第2段柱溫為210℃，升溫速率為2℃/min，于250℃恒溫10 min.以面積歸一化法得到各脂肪酸組分的相對百分含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 小球藻的生長曲線

以光密度表征藻的生長情況見圖1.由圖1知，第3天～第8天小球藻生長最為迅速.本實驗在對培養(yǎng)基滅菌時采用高壓滅菌和紫外滅菌，2種滅菌方式下藻生長情況相似，蛋白核小球藻對污水的適應(yīng)能力很強，在污水中生長良好.

圖1 城市污水培養(yǎng)中蛋白核小球藻的生長曲線Fig.1 Growth curve of Chlorella pyrenoidsa with urban sewage

2.2 蛋白核小球藻對污水中COD的凈化

圖2為蛋白核小球藻對污水中COD的去除曲線.由圖2可知，取自南湖排污口污水的初始COD濃度229.74 mg/L，蛋白核小球藻對污水的COD有較高的凈化能力.培養(yǎng)過程中2種滅菌方式對COD的降解差別很大.在第3天，紫外滅菌處理培養(yǎng)的藻的COD去除率已經(jīng)達到51.34%，而高壓滅菌處理的COD去除率僅為4.44%;在第6天，高壓滅菌處理的COD去除率達到40.92%，而紫外滅菌處理的COD則為60.91%，培養(yǎng)結(jié)束時高壓滅菌和紫外滅菌的COD去除率分別為65.57%和67.07%，最終的凈化效果相同.

圖2 城市污水培養(yǎng)中蛋白核小球藻COD的變化Fig.2 Changes of COD in cultivation of Chlorella pyrenoidsa with urban sewage

圖3為蛋白核小球藻對污水的脫氮曲線，表明其脫氮能力強，培養(yǎng)完畢脫氮率達到95%以上.其中，第3天去除率僅17.18%，而第4～6天去除率則迅速下降，第6天去除率均超過85%，相對于紫外滅菌，高壓滅菌的藻在純培養(yǎng)條件下總氮濃度下降更快.

圖3 城市污水培養(yǎng)中蛋白核小球藻總氮的變化Fig.3 Changes of TN in cultivation of Chlorella pyrenoidsa with urban sewage

圖4為蛋白核小球藻對污水中磷的去除曲線.由圖4可見，用小球藻處理初始磷濃度為4.30 mg/L的污水時，處理后的磷濃度低于0.39 mg/L，高壓滅菌和紫外滅菌方式下的去除率分別達到92.85%和88.34%，且污水中總磷濃度主要在第1～3天呈明顯下降.培養(yǎng)至第3天時，高壓滅菌處理下污水中總磷殘留量為1.38 mg/L，紫外滅菌處理的為2.3 mg/L.說明小球藻能有效去除污水中的磷含量.

圖4 城市污水培養(yǎng)中蛋白核小球藻總磷的變化Fig.4 Changes of TP in cultivation of Chlorella pyrenoidsa with urban sewage

圖5為蛋白核小球藻對污水中氨氮的去除曲線.小球藻對污水中氨氮的凈化效果十分明顯，在紫外滅菌和高壓滅菌后培養(yǎng)，污水中氨氮去除率分別達到96.71%和97.88%.當藻處于生長適應(yīng)期時，污水中氨氮去除率已分別達到93.09%和96.35%;當藻生長至第6天，污水中氨氮凈化效率達到最高.高壓滅菌下的第3～5天，污水中氨氮濃度的下降速率，較紫外滅菌處理的要快.由此可知，小球藻對污水中營養(yǎng)物質(zhì)氨氮去除效率很高.

圖5 城市污水培養(yǎng)中蛋白核小球藻氨氮的變化Fig.5 Changes of NH3-N in cultivation of Chlorella pyrenoidsa with urban sewage

2.3 蛋白核小球藻的生物量及油脂含量

圖6為2種滅菌方式下的蛋白核小球藻的生物量和油脂含量.由圖6可見，高壓滅菌的藻的純培養(yǎng)有利于生物量的富集，培養(yǎng)的藻生物量較紫外滅菌方式后培養(yǎng)的藻生物量高出43%，2種滅菌方式對油脂含量的影響不大，分別為 15.11%和17.86%.

圖6 城市污水培養(yǎng)蛋白核小球藻的生物量及油脂含量Fig.6 Biomass and lipid content of Chlorella pyrenoidsa cultivatingwith urban sewage

2.4 蛋白核小球藻脂肪酸含量

不同滅菌方式對蛋白核小球藻脂肪酸組成的影響見表1.由表1可知，C.pronoidosaNo.2的脂肪酸組成比較簡單，均為十六碳脂肪酸和十八碳脂肪酸，主要的脂肪酸組成有7種，其中飽和脂肪酸為16∶0(棕櫚酸)、18∶0(硬脂酸)，不飽和脂肪酸16∶1(棕櫚油酸)、16∶2、18∶1(油酸)、18∶2(亞油酸)、18∶3(亞麻酸).實驗表明C.pronoidosaNO.2主要為18∶1和16∶2脂肪酸，其百分含量分別為12.57%和28.94%，而16∶0和18∶3脂肪酸所占比例較小，其中紫外滅菌培養(yǎng)基的藻中18∶3脂肪酸百分含量較高，而高壓滅菌的培養(yǎng)基18∶2脂肪酸百分含量較高.單不飽和脂肪酸的量為23.22%，有利于安全儲存、運輸，以及在常溫保持液體狀態(tài).

表1 滅菌方式對蛋白核小球藻脂肪酸組成的影響Tab.1 Fatty acids compositions of C.pronoidosa with different sterilization method

3 結(jié)語

實驗結(jié)果表明，蛋白核小球藻在城市污水水中生長良好，在生長過程中利用污水中的磷、氮等有機物質(zhì)，作為自身生長的營養(yǎng)元素，培養(yǎng)后的污水中總磷含量為0.39 mg/L，總氮含量為2.37 mg/L，已達到農(nóng)田灌溉和工業(yè)生產(chǎn)的標準，同時對有機質(zhì)的降解效果也較為理想，可有效地去除COD.紫外滅菌和高壓滅菌2種方式對污水中氨氮、總磷、總氮的去除率接近，小球藻可快速有效去除氨氮，說明蛋白核小球藻可通過光合作用吸收污水中的氨氮作為營養(yǎng)物質(zhì)迅速生長;小球藻對于總氮、總磷的去除貫穿整個吸附過程，且去除率無氨氮高，說明小球藻對部分氮、磷的吸附屬于緩慢吸附.由COD的變化趨勢可知，紫外滅菌條件下，COD于第1～3天迅速下降至平穩(wěn);而在高壓滅菌條件下，在藻的生長前期COD下降很慢，但第6天開始迅速下降，原因為紫外滅菌污水培養(yǎng)中是菌藻共生，兩者的共同作用使得COD在生長初期降解較快.但高壓滅菌方式下，生長后期COD也出現(xiàn)相同的降低，說明該小球藻適應(yīng)于有機質(zhì)環(huán)境后也可有效降解COD.高壓滅菌后培養(yǎng)的藻的生物量遠高于紫外滅菌滅菌培養(yǎng)的藻，原因為紫外滅菌在培養(yǎng)的過程中存在菌藻共生，菌在生長中消耗有機營養(yǎng)元素與藻產(chǎn)生了競爭，從而不利于蛋白核小球藻生物量的積累，2種滅菌方式后培養(yǎng)的小球藻的油脂產(chǎn)量相差不大，基于生產(chǎn)成本及實現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)考慮，紫外滅菌方式更具有可行性.

通過色譜分析顯示，蛋白核小球藻脂肪酸的組成主要是十六碳脂肪酸和十八碳脂肪酸，其中紫外與高壓滅菌方式下后培養(yǎng)的藻中的單不飽和脂肪酸的量分別為23.22%和20.67%，有利于油脂的穩(wěn)定性，且其組成與植物油脂相似，可以作為制備生物柴油的原料.

［1］Woertz I，F(xiàn)effer A，Lundquist T，et al.Algae grown on dairy and municipal wastewater for simultaneous nutrient removal and lipid production for biofuel feedstock［J］.Journal of Environmental Engineering-Asce ，2009，135(11):1115-1122.

［2］Traviesoa L，Benitezíb F，Sáncheza E.Batch mixed culture of Chlorella vulgaris using settled and diluted piggery waste［J］.Ecological Engineering，2006，28:158-165.

［3］Chisti，Y.Biodiesel from microalgae［J］.Biotechnology Advances，2007，25(3):294-306.

［4］Pienkos P T，Darzins A .The promise and challenges of microalgal-derived biofuels［J］.Biofuels Bioproducts＆Biorefining-Biofpr，2009，3(4):431-440.

［5］Iverson S J，Lang SL，Cooper M H.Comparison of the Bligh and Dyer and Folch methods for total lipid determination in a broad range of marine tissue［J］.Lipids，2001，36(11):1283-1287.

［6］王心芳，魏復(fù)盛，齊文啟.水和污水檢測分析方法［M］.4版.北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002:210-284.

［7］Slover H，Lanza E.Quantitative analysis of food fatty acids by capillary gas chromatography［J］.Journal of the American Oil Chemists Society，1979，56(12):933-943.