王文凱 鐘 橋 謝立蘋(píng) 邵世和 (江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,鎮(zhèn)江212002)

溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶(Lytic transglycosylase,LT)廣泛分布于細(xì)菌,能夠水解N-乙酰胞壁酸酯(N-acetylmuramic acid,MurNAc)和 N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine,G lcNAc)之間的β-1,4糖苷鍵。與溶菌酶不同的是其不是發(fā)生水解作用,而是發(fā)揮糖基轉(zhuǎn)移酶的活性,即在N-乙酰胞壁酸酯MurNAc內(nèi)部形成了1,6糖苷鍵。由于該酶廣泛的參與細(xì)菌的分裂繁殖、生物被膜形成以及細(xì)菌毒性蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn),因此與細(xì)菌的致病性密切相關(guān)[1]。其中,廣泛分布于細(xì)菌的Ⅲ、Ⅳ型分泌系統(tǒng)中的溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶,可以水解肽聚糖層,使得胞內(nèi)蛋白進(jìn)入周漿間隙,促進(jìn)分泌轉(zhuǎn)運(yùn)裝置的裝配形成,從而使得細(xì)菌發(fā)揮毒性作用[2]。而在幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori,簡(jiǎn)稱(chēng) H.pylori)Cag致病島中,也編碼一個(gè)Ⅳ型分泌樣裝置,負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)毒性蛋白CagA進(jìn)入宿主細(xì)胞,發(fā)揮毒性作用[3]。近年來(lái),雖然Cag致病島Ⅳ型分泌樣裝置的研究取得了一定的進(jìn)展,但該分泌裝置的裝配形成機(jī)制尚未明確[4]。其中,幽門(mén)螺桿菌cag4蛋白是 H.pylori Cag致病島編碼的溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶,可以在局部水解細(xì)菌的肽聚糖層,使得胞內(nèi)蛋白釋放進(jìn)入周漿間隙,促進(jìn)分泌系統(tǒng)的裝配形成。本文利用原核表達(dá)技術(shù)成功地獲得具有良好的水解活性的cag4重組蛋白,并對(duì)其酶活性和理化特性做了初步鑒定;旨在進(jìn)一步闡明幽門(mén)螺桿菌致病機(jī)制,為新型抗生素(或是抗菌藥物)的研發(fā)提供作用靶位。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株 H.pyloriNCTC11637由中國(guó)疾病控制中心傳染病預(yù)防研究所張建中教授饋贈(zèng),大腸埃希菌DH5α及BL21(DE3)、溶壁微球菌為江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2試劑和儀器 哥倫比亞培養(yǎng)基、厭氧袋購(gòu)自O(shè)XOID公司;Ex TaqDNA聚合酶、dNTP、限制性核酸內(nèi)切酶 EcoR Ⅰ及 Xho Ⅰ、T4-DNA連接酶、IPTG、DL2000 DNA Marker及蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)購(gòu)自TaKaRa公司;DL1Kb DNA marker購(gòu)自金思特生物有限公司;Ni2+-NTA購(gòu)自Qiagen公司;pGEM-T載體購(gòu)自Promega公司;pET-28a載體由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室保存;超速離心機(jī)購(gòu)自Beckman公司;其他常規(guī)試劑按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》要求配制。

1.2幽門(mén)螺桿菌cag4蛋白基因的克隆 根據(jù)幽門(mén)螺桿菌cag4蛋白基因的全長(zhǎng)序列,設(shè)計(jì)上、下游引物：P1：5′-CGGG AATTCTTGTTTGGG AAATGG AT-3′;P2 ：5′-ATTCTCG AGCTACTCGTTATATCGCACTT-3′,在其5′端分別引入 EcoR Ⅰ、XhoⅠ酶切位點(diǎn),PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為510 bp。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。以 H.pyloriNCTC11637菌株基因組DNA為模板,用 Ex Taq聚合酶進(jìn)行 PCR擴(kuò)增(25μl反應(yīng)體系)。擴(kuò)增參數(shù)為：94℃5分鐘,94℃30秒、52℃30秒、72℃1分鐘,30個(gè)循環(huán),72℃10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色,GeNius凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)分析鑒定并用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.3T-A克隆和原核表達(dá)載體pET-28a-cag4的構(gòu)建膠回收的 PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體,加1μl T4-DNA連接酶,4°C連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌涂布于含50μg/ml氨芐青霉素的LB平板上,37℃培養(yǎng)16小時(shí)。挑取菌落轉(zhuǎn)種于含氨芐青霉素50μg/ml的LB液體培養(yǎng)基,37℃振搖12小時(shí),用堿裂解法進(jìn)行質(zhì)粒提取,并進(jìn)行EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定。

膠回收酶切目的片段,構(gòu)建表達(dá)pET-28a-cag4,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌 E.coliBL21(DE3),轉(zhuǎn)化好的細(xì)菌涂布含100μg/ml卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)12～16小時(shí),挑選單菌落接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,置37℃搖床振蕩培養(yǎng)12小時(shí),抽提質(zhì)粒,酶切鑒定。

1.4蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定 經(jīng)酶切鑒定構(gòu)建成功的重組工程菌,接種于含100μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,在37℃振蕩至菌液OD600達(dá)到0.6,加入 IPTG誘導(dǎo)后,收集菌液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。同時(shí),設(shè)立陰性對(duì)照。

取誘導(dǎo)后的菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳后,然后4℃電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉3小時(shí),換新鮮的封閉液,加入鼠抗His單克隆抗體作為一抗,37℃搖床反應(yīng)1小時(shí)。1×PBST洗滌3～5次,每次5分鐘,于1×PBST中加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔 IgG作為二抗,37℃搖床反應(yīng)1小時(shí),最后DAB顯色至目的條帶清晰時(shí)將膜轉(zhuǎn)移至雙蒸水終止反應(yīng)。

1.5蛋白的純化和復(fù)性 通過(guò)比較不同誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度后,確定了最佳誘導(dǎo)條件,即1 mmol/L IPTG,誘導(dǎo)4小時(shí)。細(xì)菌活化后,按照1∶200稀釋后加入500 ml LB中,進(jìn)行大量誘導(dǎo)。收集菌體后,重懸于 lysis buffer(50 mmol/L NaH2PO4·2H2O,300 mmol/L NaCl,5 mmol/L iminazole和8 mmol/L urea[pH8.0])中,冰上超聲破碎(200 W)。離心后,收集上清和鎳柱Ni2+-NTA(Qiagen)室溫結(jié)合1小時(shí)后純化。洗滌去除蛋白后,利用 Elute buffer(50 mmol/L NaH2PO4·2H2O,100 mmol/L NaCl,200 mmol/L imidazole,8 mmol/L urea,和 5 mmol/L DTT[pH8.0])進(jìn)行洗脫,收集蛋白后,SDS-PAGE鑒定。

蛋白透析之前將透析袋放入含2%NaHCO3和1 mmol/L EDTA的蒸餾水中煮沸10分鐘,用蒸餾水反復(fù)沖洗,再放入含1 mmol/L EDTA的蒸餾水煮沸10分鐘,自然冷卻,加入待透析的蛋白,分別用含6、4、3、2和1 mol/L尿素 PBS在4℃條件下梯度透析,各4小時(shí),最后用不含尿素的PBS平衡過(guò)夜。收集透析液,SDS-PAGE鑒定。

1.6細(xì)菌肽聚糖的提取與酶譜分析 參照Z(yǔ)eiger[5]報(bào)道的方法并加以改良,具體按以下步驟進(jìn)行。

溶壁微球菌接種LB培養(yǎng)基后,37℃培養(yǎng)過(guò)夜。收集細(xì)菌后,重懸于20 ml冰預(yù)冷的25 mmol/L磷酸鹽緩沖液中。將菌液逐滴加入煮沸的8%SDS溶液中,煮沸1小時(shí),1 000 r/min 15℃離心30分鐘收集后沉淀,再重復(fù)煮沸一次。用磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀重復(fù)5次后,再利用超速離心機(jī)4 000 r/min 25℃離心30分鐘后,收集后乙醚脫脂后,干燥獲得肽聚糖。

酶譜分析,即將收集的肽聚糖作為底物,摻入12%的分離膠中,進(jìn)行SDS-PAGE電泳[6]。電泳后,采用復(fù)性緩沖液(20 mmol/L sodium phosphate buffer[pH7.0],0.1%Triton X-100和10 mmol/L MgCl2),37℃孵育48小時(shí)。采用1%的亞甲基藍(lán)染色后,雙蒸水脫色。實(shí)驗(yàn)過(guò)程,設(shè)立溶菌酶和牛白蛋白分別為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

1.7濁度實(shí)驗(yàn) 將熱致死后的溶壁微球菌,重懸于不同pH值的磷酸鹽緩沖液(pH5.0～7.0)中,調(diào)整到其濁度在OD600為1.0。分別加入5μg/ml的重組蛋白后,37℃孵育,監(jiān)測(cè)其濁度值的變化速率,計(jì)算ΔA·min-1mg-1(protein)值代表酶活性的大小[7,8]。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 每組樣本測(cè)定重復(fù)3次。所有檢測(cè)值均以±s表示。組間差異的比較采用兩樣本間 t檢驗(yàn),P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1幽門(mén)螺桿菌cag4蛋白與其他溶菌轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列同源性分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),檢索獲得不同細(xì)菌分泌系統(tǒng)中溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶的基因序列。再根據(jù)PFAM數(shù)據(jù)庫(kù),搜索分析這些溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶的催化保守區(qū)域,再采用clustalX 1.8將這些催化區(qū)域進(jìn)行多重序列比較分析后,利用GenDoc軟件顯示結(jié)果。結(jié)果顯示,序列之間具有一定的保守性。其中,幽門(mén)螺桿菌 cag4蛋白中第 56位氨基酸(G LU56),被推測(cè)認(rèn)為是發(fā)揮溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性的活性中心。

2.2原核表達(dá)載體pET-28a-cag4的構(gòu)建 PCR結(jié)果顯示在510 bp左右有一條帶,與預(yù)計(jì)大小一致,無(wú)非特異性條帶。將PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α,隨機(jī)挑取菌落,抽提質(zhì)粒,雙酶切產(chǎn)物電泳后,陽(yáng)性克隆出現(xiàn)的兩條帶分別位于約3 003 bp和510 bp處(見(jiàn)圖1)。

質(zhì)粒pET-28a和TA克隆鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒分別經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后,回收酶切片段,16℃連接過(guò)夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 E.coliBL21,隨機(jī)挑取菌落,抽提質(zhì)粒,雙酶切產(chǎn)物電泳后,陽(yáng)性克隆出現(xiàn)的兩條帶分別位于5.3 kb和510 bp處(見(jiàn)圖2)。

2.3幽門(mén)螺桿菌cag4蛋白重組蛋白的表達(dá)與純化

圖1 pGEM-T-cag4質(zhì)粒雙酶切鑒定圖Fig.1 Double restriction enzyme digestion map of the recombinant plasmid pGEM-T-cag4

圖2 pET-28a-cag4質(zhì)粒酶切鑒定圖Fig.2 Double restriction enzyme digestion map of the recombinant plasmid pET-28a-cag4

圖3 SDS-PAGE和Western blot鑒定結(jié)果圖Fig 3 The result of SDS-PAGEand Western blot

原核表達(dá)載體pET-28a-cag4轉(zhuǎn)化至 E.coliBL21中獲得重組工程菌,接種LB液體培養(yǎng)基,于37℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6時(shí),加入終濃度為1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4小時(shí),收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè),可見(jiàn)在約Mr23kD處出現(xiàn)1條新的蛋白帶(見(jiàn)圖3),與理論預(yù)測(cè)值基本相符?？蛰d體轉(zhuǎn)化菌pET-28a/BL21誘導(dǎo)后和未誘導(dǎo)重組工程菌在同一位置未出現(xiàn)相應(yīng)的蛋白帶。將誘導(dǎo)后的全菌進(jìn)行SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)移至NC膜上,依次加入一抗體和二抗,DAB顯色后在相對(duì)分子量為23 000的新生蛋白帶處,有一特異性條帶,同時(shí)以空載體菌為對(duì)照,未發(fā)現(xiàn)條帶,說(shuō)明該蛋白帶為目的蛋白,見(jiàn)圖3。育處理。結(jié)果如圖4可見(jiàn),加入溶菌酶和重組蛋白幽門(mén)螺桿菌cag4蛋白的泳道2、3,都有明顯的溶解痕跡,而蛋白的泳道1未見(jiàn)。其中,溶菌酶的分子量大小約為14.4 kD,而幽門(mén)螺桿菌cag4蛋白約為23 kD。結(jié)果說(shuō)明幽門(mén)螺桿菌NTCT11637 cag4蛋白具有溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶活性。

圖4 酶譜分析結(jié)果圖Fig.4 The zymogram analysis of cag pathogenicity island protein 4

圖5 重組cag4在不同pH條件下的酶活性大小Fig.5 The enzyme activity of recombinant cag pathogenicity island protein 4 at different pHvalues

2.5不同pH條件下的酶活性變化 將溶壁微球菌重懸于不同pH值的磷酸鹽緩沖液(5.0,6.0,7.0)中,調(diào)整OD600為1.0,分別加入濃度為5μg/ml的重組 CAG4蛋白,37℃作用,間隔 15分鐘測(cè)定OD600,連續(xù)測(cè)定2小時(shí),每次重復(fù)測(cè)定3次。結(jié)果如圖5所示,發(fā)現(xiàn)pH6.0組的OD600下降速率,較其他組呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)。說(shuō)明幽門(mén)螺桿菌NTCT11637 cag4蛋白在偏酸性環(huán)境(pH6.0)下,其酶活性較強(qiáng)。采用ΔA·min-1mg-1值計(jì)算不同pH組酶活性大小,每次結(jié)果重復(fù)測(cè)定3次,計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差,結(jié)果以±s表示;組間差異采用兩樣本t檢驗(yàn),結(jié)果表明P＜0.05,呈顯著性差異,如圖所示,pH6.0時(shí)的該酶活性較強(qiáng)。

3 討論

收集菌體溶解于裂解液中,冰上30分鐘后,超聲破碎,10 000×g離心收集上清和沉淀,沉淀溶解于裂解液中,SDS-PAGE電泳分析目的蛋白的溶解度,發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要存在于沉淀中,即以包涵體形式存在表達(dá),故采用變性條件下純化蛋白。純化后,采用SDS-PAGE電泳鑒定表明,蛋白純度達(dá)98%以上,見(jiàn)圖4。純化后蛋白,進(jìn)一步采用透析法進(jìn)行蛋白的復(fù)性處理。

2.4重組蛋白酶活性的鑒定 復(fù)性處理后的蛋白,加入摻入溶壁微球菌為底物的聚丙烯酰氨凝膠中,100 V 2小時(shí)電泳分離后,進(jìn)行復(fù)性處理和37°C孵

H.pylori感染在世界范圍內(nèi)流行,現(xiàn)已證實(shí)感染H.pylori者,特別是 Ⅰ型H.pylori(含 Cag-PAI),可以導(dǎo)致慢性胃炎、消化性潰瘍,甚至胃癌和粘膜相關(guān)性淋巴瘤(MALT)的發(fā)生[3]?，F(xiàn)已證明,CagPAI是編碼一個(gè)IV型樣分泌系統(tǒng)(type IV like secretion system)轉(zhuǎn)運(yùn)CagA蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞,發(fā)揮毒性作用,導(dǎo)致一系列的病理變化[3]。雖然目前對(duì)該結(jié)構(gòu)的研究取得了一定的進(jìn)展,但仍有許多問(wèn)題尚未闡明,如其裝配形成機(jī)制,底物蛋白識(shí)別機(jī)制等等。然而,細(xì)菌的肽聚糖層作為天然的屏障,給該多蛋白復(fù)合物的組裝形成,造成了很大的困難。因此,分泌系統(tǒng)中發(fā)揮溶菌功能的組分,如VirB1、ORF169等,在多蛋白復(fù)合物裝配形成過(guò)程中起重要的作用。然而,這些溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶在氨基酸序列上存在著很大的差異,可能僅僅是部分序列發(fā)揮水解肽聚糖功能,如根瘤農(nóng)桿菌VirB/D轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中VirB1[9]。因此,我們將不同細(xì)菌分泌系統(tǒng)中的溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶,利用PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得其發(fā)揮酶活性的保守功能域,進(jìn)行多重序列之間的比對(duì)研究。結(jié)果表明cag4基因和其他細(xì)菌分泌系統(tǒng)中溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶具有高度的同源性。其中,在α-螺旋結(jié)構(gòu)的末端存在一個(gè)保守的谷氨酸(G lu),可以形成一個(gè)催化的活性中心,發(fā)揮催化活性作用。結(jié)合Slt35的三維晶體結(jié)構(gòu)研究表明,在溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列中還存在一個(gè)保守的AVG AY基序,可能是與肽聚糖結(jié)合作用的功能域[10](圖1)。

臨床上H.pylori感染常采用根除治療,但根除之后可以導(dǎo)致體內(nèi)的菌群比例失衡,易產(chǎn)生新的胃腸道疾病。因此,根除療法勢(shì)必不是理想的治療手段。另一方面,隨著對(duì)克拉霉素和甲硝唑等抗生素的原發(fā)耐藥率普遍上升,也對(duì)這種治療方案提出了新的挑戰(zhàn)。尋找和研制新型抗生素或是抗菌藥物迫在眉睫。溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶是細(xì)菌分泌毒性蛋白關(guān)鍵酶之一,具有良好的保守性,是新型抗生素良好的候選作用靶位。此次利用原核表達(dá)技術(shù),重組獲得了大量具有酶活性的幽門(mén)螺桿菌cag4蛋白,為其結(jié)構(gòu)與功能的研究和生物抑制劑的研發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶,與溶菌酶不同的是能在N-乙酰胞壁酸酯MurNAc內(nèi)部形成了1,6糖苷鍵。而國(guó)外學(xué)者通過(guò)對(duì)其水解產(chǎn)物進(jìn)行HPLC-MS質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn),其主要的水解產(chǎn)物是胞壁肽、四肽(Muropeptide G lcNAc-(1,6 anhydro) MurNAc-tetrapeptide)等[11,12]。而這些水解產(chǎn)物,可以被胞內(nèi)受體Nod1識(shí)別,活化初始免疫應(yīng)答,導(dǎo)致炎癥因子釋放[13,14]。因此,我們可以推測(cè)：H.pylori在感染過(guò)程中,幽門(mén)螺桿菌cag4蛋白不僅僅水解肽聚糖,促進(jìn)分泌系統(tǒng)的裝配而發(fā)揮致病作用,還可以利用其水解產(chǎn)物,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。此外,在分泌系統(tǒng)裝配過(guò)程中,溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶,水解肽聚糖釋放蛋白質(zhì)進(jìn)入周漿間隙,組裝形成分泌裝置。但這種作用釋放勢(shì)必要得到及時(shí)的終止,才能避免多蛋白的聚集,而影響其裝配形成效率。那么,細(xì)菌又是如何控制其表達(dá),或是分泌其他抑制劑來(lái)終止這種反應(yīng)呢?這些問(wèn)題都值得進(jìn)一步深入研究。

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