王華麗 吳移謀 鄭江花 朱翠明 李忠玉 周 洲 余敏君

(南華大學(xué)病原生物研究所,衡陽421001)

肺炎嗜衣原體(Chlamydophila pneumoniae,Cpn)是人類重要的呼吸道病原體,它可引起非典型肺炎,還可引起咽炎、支氣管炎、鼻竇炎、中耳炎等,并導(dǎo)致了平均10%的社區(qū)獲得性肺炎的發(fā)生[1,2]。Cpn的人群感染極為普遍,據(jù)統(tǒng)計,全球20歲以上的成人幾乎都受到過Cpn的感染,血清流行病調(diào)查也顯示,成人中Cpn的抗體陽性率可達50%～70%。臨床上Cpn的感染多以隱性、持續(xù)性感染的形式存在,感染易反復(fù)遷延,造成組織病理損傷,致使嚴重的心血管系統(tǒng)并發(fā)癥的發(fā)生[3,4]。因此,研究Cpn的致病因素,闡明毒力相關(guān)蛋白的致病作用及機制對預(yù)防Cpn感染,控制其傳播具有重要意義。

衣原體蛋白酶樣活性因子(Chlamydial proteaselike activity factor,CPAF),是由衣原體合成并分泌到宿主細胞內(nèi)的蛋白,是Cpn和宿主之間相互作用的途徑之一,且其抗原性明顯強于MOMP和HSP60[5,6]。為進一步了解CPAF的潛在致病性,本研究將純化的CPAF重組蛋白以滴鼻和靜脈方式接種BALB/c小鼠,觀察CPAF對小鼠肺組織的炎癥損傷作用及對炎癥細胞因子IL-6、TNF-α水平的影響,為進一步研究CPAF蛋白的生物學(xué)功能,了解Cpn的致病機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒 pGEX6p-2/CPAFm原核表達體、pGEX6p-2原核表達載體、E.coliBL21、E.coliJM109均為病原生物學(xué)研究所保存。

1.2主要儀器和試劑 GST瓊脂糖凝膠FF純化柱購自北京天來公司(Qiagen company);小鼠 TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒購自北京晶美公司。倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司,Multiskan MK-3全自動酶標儀購自芬蘭雷勃公司。

1.3重組蛋白的表達和純化 將本實驗室保存并已證實轉(zhuǎn)入Cpn-CPAF的181～400 aa基因(CPAFm)的重組表達菌接種于含100μg/ml的LB培養(yǎng)液中[7],于37℃培養(yǎng)至OD600為0.6～1.0時,加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)。離心后收集菌體,加入細胞裂解液,4℃過夜;反復(fù)凍融后超聲破菌,收集沉淀用包涵體洗滌液沖洗三次;離心后取沉淀加入包涵體溶解液中過夜。再次離心后,在上清中先后加入GST融合蛋白復(fù)性液和“萬金油”透析復(fù)性液中進行孵育,使重組蛋白充分復(fù)性。然后按說明書用 GST瓊脂糖凝膠FF進行純10%SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)的表達形式及純度;采用A280紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度。以上的蛋白在使用前經(jīng)100 μg/ml多粘菌素B預(yù)孵育2小時以消除在蛋白提取過程中可能污染的內(nèi)毒素[8]。

1.4實驗動物和分組 健康清潔級BALB/c雌性小鼠70只,6～8周,體重18～22 g(本校實驗動物中心提供)。隨機分成7組,每組10只：①鼻內(nèi)滴入組：將A、B、C組的BALB/c小鼠用2%戊巴比妥鈉2.3 ml/kg腹腔注射輕微麻醉,誘導(dǎo)小鼠過度通氣;用帶有4號針頭的注射器于吸氣相時,A組向鼻孔內(nèi)滴入50μl GST-CPAFm(含100μg GST-CPAFm)[7],B 組向鼻孔內(nèi)滴入50μl GST(含100μg GST),C組向鼻孔內(nèi)滴入50μl PBS,小鼠保持仰臥或直立位,以確保液體全部吸入肺部;②尾靜脈注射組：將D、E、F組的BALB/c小鼠尾部消毒后,用帶有4號針頭的注射器經(jīng)尾靜脈分別注射50μl GST-CPAFm(含100μg GSTCPAFm)、50μl GST(含 100μg GST)、50μl PBS;③正常組G組,不做任何處理。第3天和第6天同種方法處理BALB/c小鼠,第7天處死BALB/c小鼠[5,7]。

1.5病理檢查 每組隨機取5只BALB/c小鼠打開胸腔,分離并取下肺組織經(jīng)4%多聚甲醛灌注固定后制成HE病理切片,觀察肺組織炎癥反應(yīng)情況。

1.6采血及收集支氣管肺泡灌洗液 每組余下的5只BALB/c小鼠摘眼球取血用于白細胞計數(shù)及分類,其余血收集到 EP管中,靜置于37℃10分鐘后1 500 r/min離心8分鐘,血清-20℃保存。固定打開胸腔并分離頸部皮膚和肌肉,暴露器官與肺組織,在甲狀腺水平將氣管剪開一小口,用2號針頭注射器吸取0.5 ml PBS,緩慢注入肺內(nèi),可見BALB/c小鼠肺臟逐漸膨脹、變白,緩慢回抽灌洗液,再將其緩慢注回肺內(nèi),重復(fù)1次,最后將收集到的BALF注入1.5 ml EP管中(置于冰浴中,防止細胞粘連),此為第一次灌洗,共灌洗3次,灌洗液回收率＞80%,回收(1.4±0.2)ml。BALF經(jīng)4 ℃離心1 500 r/min離心8分鐘后,在1小時內(nèi)作細胞計數(shù),上清液于-20℃儲存。

1.7血清及BALF中IL-6、TNF-α水平的測定 按小鼠IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測試劑盒說明書進行。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理 所有重復(fù)實驗數(shù)據(jù)用±s表示,用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析,多組間均數(shù)比較用單因素方差分析,兩兩比較用LSD法,設(shè)顯著性水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1肺組織病理學(xué)變化 正常組、鼻內(nèi)滴入GST組和PBS組,尾靜脈注射 GST組和PBS組肺組織結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁薄,肺泡間質(zhì)無明顯炎癥細胞浸潤,血管壁及周圍無明顯炎癥細胞浸潤,支氣管管壁規(guī)則,管腔無明顯炎癥細胞滲出(圖 1B、C、E、F、G);GSTCPAFm重組蛋白鼻內(nèi)滴入組和尾靜脈注射組可看到滲出性炎癥病灶,病變部位有大量淋巴細胞、單核細胞和中性粒細胞浸潤,肺泡間隔明顯增寬,支氣管腔內(nèi)有較多炎癥細胞滲出,支氣管及血管周圍有大量淋巴細胞浸潤(圖1A、D)。

圖1 各組BALB/c小鼠肺組織病理改變(HE,×200)Fig.1 Pathological changes of the lung tissue(HE,×200)

2.2BALB/c小鼠外周血及BALF中白細胞總數(shù)GST-CPAFm重組蛋白鼻內(nèi)滴入組和尾靜脈注射組BALB/c小鼠BALF中白細胞總數(shù)明顯高于正常組、鼻內(nèi)滴入 GST組和 PBS組,尾靜脈注射 GST組和PBS組(表 1)。

2.3BALB/c小鼠外周血及BALF中 IL-6、TNF-α的水平

表1 各組BALB/c小鼠外周血、BALF中的白細胞總數(shù)(±s)Tab.1 Total white blood cells(TWBC)in BALB/c mouse peripheral blood BALF of different groups(±s)

表1 各組BALB/c小鼠外周血、BALF中的白細胞總數(shù)(±s)Tab.1 Total white blood cells(TWBC)in BALB/c mouse peripheral blood BALF of different groups(±s)

Note：1)P＜0.05 vs B and C group;2)P＜0.01 vs Ggroup.

Groups NumberTWBC in peripheral blood(×109L-1)TWBC in BALF(×107L-1)Nasal instillation A 5 6.63±1.50 9.66±1.191)B 5 5.88±0.63 8.14±0.67 C 5 5.83±1.11 7.94±1.06 Tail vein injection D 5 7.11±1.29 9.28±1.582)E 5 6.18±0.59 7.84±0.46 F 5 6.12±0.66 7.82±1.12 Normal G 5 5.99±0.71 7.48±0.70 Fvalue 1.1 3.19

表2 各組小鼠外周血、BALF中 IL-6、TNF-α的水平(pg/ml,±s)Tab.2 Levels of IL-6 and TNF-αin BALB/c mouse peripheral blood or BALF of different groups(pg/ml,±s)

表2 各組小鼠外周血、BALF中 IL-6、TNF-α的水平(pg/ml,±s)Tab.2 Levels of IL-6 and TNF-αin BALB/c mouse peripheral blood or BALF of different groups(pg/ml,±s)

Note：1)P＜0.01,vs B,C and Ggroup;2)P＜0.01,vs E,F and Ggroup;))

Groups Number IL-6 TNF-α Serum Nasal instillation A 5 22.13±4.351) 49.74±5.413)4)B 5 15.47±1.57 39.25±9.93 C 5 13.85±2.06 37.07±5.79 T ail vein injection D 5 24.04±6.192) 31.90±6.66 E 5 15.14±2.29 35.07±5.37 F 5 16.06±2.71 37.86±8.55 Normal G 5 15.46±2.23 36.02±4.93 Fvalue 6.68 3.34 BALF Nasal instillation A 5 43.49±12.251)93.30±20.911)B 5 25.37±5.36 58.89±9.54 C 5 23.48±2.63 52.21±9.38 T ail vein injection D 5 40.60±10.642)86.88±20.912)E 5 28.24±2.37 52.80±7.47 F 5 27.53±3.29 55.67±6.23 Normal G 5 25.93±4.37 51.41±3.71 Fvalue 6.65 9.53

2.3.1BALB/c小鼠外周血中 IL-6、TNF-α的水平GST-CPAFm重組蛋白鼻內(nèi)滴入組組外周血中炎癥因子IL-6水平顯著高于正常組、鼻內(nèi)滴入GST組和PBS組(均P＜0.01),TNF-α水平明顯高于鼻內(nèi)滴入GST組(P＜0.05)、鼻內(nèi)滴入 PBS組(P＜0.01)和正常組(P＜0.01);GST-CPAFm重組蛋白尾靜脈注射組組外周血中炎癥因子IL-6的水平明顯高于正常組、尾靜脈注射 GST組和PBS組(均P＜0.01,表2)。

2.3.2BALB/c小鼠BALF中 IL-6、TNF-α的水平GST-CPAFm重組蛋白鼻內(nèi)滴入組和尾靜脈注射組BALF中炎癥因子 IL-6、TNF-α的水平明顯高于正常組、鼻內(nèi)滴入 GST組和 PBS組,尾靜脈注射 GST組和 PBS組(均P＜0.01,表2)。發(fā)現(xiàn)炎癥早期升高的TNF-α可促使更多的免疫細胞參與對病原微生物的反應(yīng),之后由升高降到了正常水平的情況相似,也有研究顯示TNF-α可誘導(dǎo)IL-10及IL-4的合成,而 IL-4及 IL-10可強烈抑制TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥介質(zhì)的合成[12,13]。這樣形成一種促炎癥反應(yīng)與抗炎癥反應(yīng)之間的多環(huán)節(jié)反饋調(diào)節(jié)機制,以維持機體內(nèi)炎癥介質(zhì)與抗炎介質(zhì)之間的平衡。我們推測本實驗在檢測的時候外周血中的TNF-α水平可能已經(jīng)由高值降為了正常水平,其原因可能是激發(fā)了其他細胞因子在一定程度上抑制TNF-α的產(chǎn)生,關(guān)于這一點還有待進一步研究。本實驗研究表明,重組蛋白 GST-CPAFm能在BALB/c小鼠體內(nèi)引起肺組織炎癥損傷和細胞因子TNF-α和IL-6的水平升高,推測肺損傷可能與其引起TNF-α和 IL-6的水平升高有關(guān),在一定程度上證實CPAF可能是Cpn的一個重要致病因子,為進一步研究CPAF蛋白的生物學(xué)功能奠定了實驗基礎(chǔ)。

3 討論

CPAF是第一個發(fā)現(xiàn)的由衣原體基因編碼合成并分泌到宿主細胞內(nèi)的蛋白酶樣活性因子,可降解宿主細胞的轉(zhuǎn)錄因子RFX5、USF-1和裂解角蛋白8并具有很強的免疫活性,在衣原體的致病過程中及衣原體與宿主的相互作用中發(fā)揮著重要作用[9,10]。

本實驗將復(fù)性純化的GST-CPAFm重組蛋白,經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定后按鼻內(nèi)滴入和尾靜脈兩種途徑接種BALB/c小鼠,觀察BALB/c小鼠肺組織的病理變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種方式都能引起B(yǎng)ALB/c小鼠出現(xiàn)局灶性肺炎,表現(xiàn)為肺泡間隔增厚,伴較多炎癥細胞浸潤,病變較重者支氣管周圍及血管周圍可見淋巴細胞浸潤,對照組未見明顯變化。對BALF的檢測顯示白細胞總數(shù)以及炎癥因子TNF-α和IL-6的水平顯著升高。此外,尾靜脈注射 GSTCPAFm重組蛋白的小鼠外周血炎癥因子IL-6、TNF-α水平也明顯升高。

IL-6 和 TNF-α是重要的促炎介質(zhì)。IL-6、TNF-α兩者在炎癥反應(yīng)急性相中聯(lián)系緊密,TNF-α等可誘導(dǎo)IL-6生成,IL-6刺激肝臟產(chǎn)生大量的C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP),而血中CRP水平是反映機體炎癥反應(yīng)的敏感指標。IL-6主要由單核-吞噬細胞、血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等產(chǎn)生,該因子具有范圍較寬的體液免疫、細胞免疫作用和促凝血作用,與炎癥反應(yīng)、組織損傷有關(guān)系。IL-6能誘導(dǎo)纖維蛋白原產(chǎn)生、啟動凝血因子,刺激炎癥部位形成微血栓,抑制內(nèi)皮細胞修復(fù),使血管受損及高通透狀態(tài)延遲,并伴有組織炎性細胞浸潤及氣管肺泡粘膜損傷,使炎癥進一步惡化,造成肺損傷。另一方面一定程度的升高,可以使炎癥局限化,對機體具有保護作用[11]。顯然,重組蛋白CPAF可以引起肺組織的炎癥損傷,且細胞因子在其中扮演了更重要的角色。

實驗發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射GST-CPAFm重組蛋白的外周血中的TNF-α水平并沒有升高。這與某些研究

1 Kumar S,Hammerschlag M R.Acute respiratory infection due to Chlamydia pneumoniae：current status of diagnostic methods[J].Clin Infect Dis,2007;44(4)：568-576.

2 周 洲,吳移謀.衣原體主要外膜蛋白的研究現(xiàn)狀[J].國外醫(yī)學(xué)·微生物學(xué)分冊,2005;28(2)：29-31.

3 Samransamruajkit R,Jitchaiwat S,Wachirapaes Wet al.Prevalence of mycoplasma and chlamydia pneumonia in severe community-Acquired pneumonia among hospitalized children in Thailand[J].Jpn J Infect Dis,2008;61(1)：36-39.

4 劉 瑋,何 平,成 蓓et al.肺炎衣原體對 SR-A1和 CD36表達的影響及相關(guān)信號機制研究[J].中國免疫學(xué)雜志,2009;25(11)：973-977.

5 Zhong G,Fan P,Ji Het al.Identification of a chlamydial protease-like activity factor responsible for the degradation of host transcription factors[J].J Exp Med,2001;193(8)：935-942.

6 Halvoren D S,Borvik T,Njolstad Iet al.Chlamydia pneumoniae IgA-and IgGantibodies in young survivors of myocardial infarction a comparison of antibody detection by a microimmunofluorescence test and an enzyme immunoassay[J].Intern Med J,2002;251(2)：142-147.

7 鄭江花,吳移謀,劉佳強et al.肺炎嗜衣原體蛋白酶樣活性因子免疫優(yōu)勢區(qū)基因重組蛋白在早期診斷中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)報,2008;48(4)：520-525.

8 Rawadi G,Roman-Roman S.Mycoplasma membrane lipoproteins induced proinflammatory cytokinesby a mechanism distinctfrom thatof lipopolysaccharide[J].Infect Immun,1996;64(2)：637-643.

9 Zhong G,Liu L,Fan Tet al.Degradation of t ranscription factor RFX5 during the inhibition of both constitutive and interferon gammar inducible major histocompatibility complex class I expression in chlamydia infected cells[J].J Exp Med,2000;191(9)：1525-1534.

10 Dong F,Su H,Huang Yet al.Cleavage of host keratin 8 by a Chlamydia secreted protease[J].Infect Immun,2004;72(7)：38632-38638.

11 Finlay B B,McFadden G.Anti-immunology：evasion of the host immune system by bacterial and viral pathogens[J].Cell,2006;124(4)：767-782.

12 Mijatovic T,Kruys V,Caput Det al.Interleukin-4 and-13 inhibit tumor necrosis factor-alpha mRNA translational activation in lipopolysaccharide-induced mouse macrophages[J].J Biol Chem,1997;272(22)：14394-143981.

13 Zhou Y,Lin G,Baarsch Met al.Interleukin-4 suppresses inflammatory cytokine gene transcription in porcine macrophages[J].J Leukoc Biol,1994;56(4)：507-513.