李 娜 劉建勛 曾瑞紅 (河北醫(yī)科大學免疫教研室,石家莊050017)

呼吸道合胞病毒(RSV)是嬰幼兒下呼吸道感染的最重要病原,主要引起肺炎和支氣管炎,嚴重感染者可導致哮喘綜合征;另外,RSV也是老年人和免疫缺陷成人哮喘、肺炎、支氣管炎的主要病因,隨著老齡社會的來臨,因RSV感染而住院和死亡的老年人數逐年上升[1]。接種疫苗是重要的預防措施,世界衛(wèi)生組織已將RSV疫苗定為優(yōu)先發(fā)展的疫苗之一,但由于免疫病理相關的安全性問題,至今尚無安全有效的疫苗上市。粘附蛋白G是RSV的兩種主要跨膜糖蛋白之一,是RSV感染后適應性免疫應答的靶標,M2蛋白是RSV的基質蛋白,含有特異性細胞毒性T細胞(CT L)表位。我們制備了一例RSV重組蛋白疫苗 G1F/M2,含有 G蛋白的中和抗體表位片段(G：125-225)和RSV-M2蛋白的CD8+T細胞表位片段(M2：81-95),并已經對其免疫原性和保護性進行了廣泛的研究[2,3]。含非甲基化CpG基序的DNA或寡核苷酸(CpGODN)是目前已知的最有潛力的佐劑,通過激活T oll-like受體9(T LR9)等受體激活細胞,不僅能刺激固有免疫而且還能激活適應性免疫應答[4]。本實驗人工合成了硫代CpG2216寡核苷酸(簡稱CpG),將其作為佐劑與重組疫苗 G1G/M2共免疫BALB/c小鼠,研究其對G1F/M2的細胞免疫原性的佐劑效應。胞;取1×106ml-1SP2/0細胞,加入 G1F/M2蛋白至終濃度為10μmol/L,置CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)2小時得靶細胞;將效應細胞與靶細胞SP2/0-NS3按效靶比50∶1加載到96孔細胞培養(yǎng)板中,未刺激的SP2/0細胞作為對照細胞,同時設置靶細胞SP2/0自然釋放LDH孔和最大釋放LDH孔,分別設3個復孔,在CO2培養(yǎng)箱37℃共培養(yǎng)6小時,根據LDH釋放試劑盒說明書檢測CT L活性。特異性細胞殺傷率(%)=(試驗組OD值-自然釋放組OD值)/(最大釋放OD值-自然釋放組OD值)。

1.2.4流式細胞術分析小鼠脾細胞中T細胞的分化情況 無菌取脾,研磨,取100μl 1×107ml-1脾細胞懸液置流式檢測管中,一式兩份,分別加入10μl標記抗體(FITC-anti-mouseCD4,PE-anti-mouse CD44,Pecy5-anti-mouse CD62L)或(FITC-anti-mouseCD8,PE-anti-mouse CD44,Pecy5-anti-mouse CD62L),混勻 ,4 ℃避光孵育40分鐘,加入1.5 ml PBS,混勻,1 200 r/min水平離心5分鐘洗滌細胞1次,細胞沉淀用1 000μl PBS懸起,用流式細胞儀分析。

1.2.5ELISPOT法檢測分泌IFN-γ和IL-4的細胞每組檢測4只小鼠,每只小鼠的脾細胞樣品設3個復孔,按試劑盒說明操作：在96孔濾膜板中加100 μl/孔的70%乙醇,室溫放置10分鐘,倒掉乙醇,用PBS或包被緩沖液洗滌;加100μl/孔適當稀釋的捕獲抗體,4℃包被過夜;傾空板子,用包被緩沖液洗滌2次,加200μl/孔 RPMI1640完全培養(yǎng)基,室溫封閉1小時;棄液 ,加入20μg/100μl/孔用RPMI1640稀釋的抗原G1F/M2;每孔加入脾細胞106個/100μl,在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時;將培養(yǎng)物倒掉,拍干,用PBST洗滌3次,加100μl/孔生物素標記的檢測抗體,室溫放2小時。棄液,用PBST洗滌4次,加100μl/孔親和素標記的辣根過氧化物酶,室溫放置45分鐘,洗滌,加 100μl/孔新配置的 AEC(3-amino-9-ethyl carbazole)底物液,室溫顯色10～60分鐘,觀察斑點形成。加200μl/孔蒸餾水洗板3次終止反應。自然干燥,用讀板機讀板。

1.3統計學分析 用統計軟件SPSS10.0分析,組間均數差異應用LSD-t檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

1 材料與方法

1.1試劑和動物 ELISPOT試劑盒為Cayman公司產品;流式細胞儀檢測用標記抗體為eBioscience公司產品。堿性磷酸酶標記的IgG購自中山生物技術公司,堿性磷酸酶標記的IgG1和IgG2a二抗為Caltag Laboratories Inc.公司產品;鋁鹽佐劑alhydrogel為丹麥產品。96孔PVDF濾膜板MAIP S4510為Millipore產品。LDH(乳酸脫氫酶)細胞毒性檢測試劑盒購自南京建成生物公司。蛋白純化柱購自GE公司。硫代CpG2216由 Invitrogen公司合成。6周齡雌性BALB/c小鼠購自河北省實驗動物中心。

1.2方法

1.2.1G1F/M2蛋白的制備[5,6]取 PET-G1F/M2質粒轉化E.coliBL21菌,37℃培養(yǎng),用 IPTG誘導表達,產物進行SDS-PAGE分析。反復凍融破菌,用6 mol/L尿素溶解包涵體,用Ni+親和層析純化;梯度透析復性。

1.2.2小鼠分組及免疫 將雌性BALB/c小鼠隨機分為6組,分別為：G1F/M2+CpG(i.n.)、G1F/M2+CpG(i.p.)、G1F/M2+Al(OH)3+CpG(i.p.)、G1F/M2(i.n.)、G1F/M2(i.p.)和正常對照組。每組6只小鼠,2周免疫一次,共免疫3次,最后一次免疫后2周殺小鼠,取脾細胞。用于CT L活性、分泌IFN-γ和 IL-4的細胞、細胞因子檢測和CD4+/CD8+記憶細胞的檢測。

1.2.3用LDH釋放法檢測CT L活性 取脾細胞,用20μg G1F/M2蛋白體外刺激脾細胞5天得效應細

2 結果

2.1脾細胞的特異性殺傷活性 各組免疫小鼠的脾細胞在體外與靶細胞共孵育6小時后,用LDH方法檢測CT L活性,結果如圖1所示。CpG2216作為G1F/M2蛋白的鼻腔免疫佐劑顯著增強了其誘導的特異性殺傷效應(圖1A)。如圖1B顯示,CpG2216與G1F/M2混合后經腹腔注射誘導的特異性殺傷活性顯著高于單獨 G1F/M2腹腔注射誘導的殺傷活性,而且將CpG2216和G1F/M2與常規(guī)佐劑Al(OH)3混合后再經腹腔注射免疫誘導了更強的殺傷活性。

2.2ELISPOT檢測免疫小鼠脾臟分泌IFN-γ和IL-4的淋巴細胞的水平 各組免疫小鼠脾細胞在體外用抗原 G1F/M2刺激后,ELISPOT檢測分泌 IFN-γ和IL-4的淋巴細胞數。如圖2A所示：CpG+G1F/M2鼻腔免疫(i.n.)組誘導的分泌 IFN-γ和 IL-4的淋巴細胞數均顯著多于 G1F/M2鼻腔免疫(i.n.)組;無論是CpG+G1F/M2(i.n.)還是 G1F/M2(i.n.),所誘導產生的分泌 IFN-γ的淋巴細胞數顯著多于分泌IL-4的淋巴細胞數。圖2B顯示的是腹腔注射免疫的結果：CpG+G1F/M2(i.p.)以及 CpG+Al+G1F/M2(i.p.)誘導了大量的分泌 IFN-γ的淋巴細胞,顯著多于 G1F/M2單獨免疫組,且CpG+Al+G1F/M2與CpG+G1F/M2組的細胞數之間具有顯著差異;對應的各組所產生的分泌IL-4的淋巴細胞數顯著少于分泌 IFN-γ的淋巴細胞數,另外,CpG+Al+G1F/M2(i.p.)與CpG+G1F/M2(i.p.)組之間的也有顯著差異。已知IFN-γ是典型的Th1型細胞因子,而IL-4則是典型的Th2型細胞因子,從以上結果可見：無論是鼻腔免疫還是腹腔注射免疫,CpG2216單獨作為佐劑或與Al(OH)3聯合作為佐劑均誘導了Th1型優(yōu)勢應答,有利于宿主抗病毒;另外,從圖2A和B可見,在誘導Th1型優(yōu)勢應答方面,兩種佐劑聯合使用強于CpG2216單獨使用,腹腔注射免疫比鼻腔免疫效果好。

圖1 G 1F/M2免疫BALB/c小鼠誘導RSV特異性的殺傷效應Fig.1 Induction of specific lysis activity in BALB/c mice following G1F/M2 immunization

圖2 被免疫的小鼠體內產生的抗原特異性的分泌IFN-γ和IL-4的細胞數Fig.2 The frequency of antigen-specific IFN-γor IL-4-secreting T cells in splenocytes of mice immunized

2.3脾細胞中的CD4+和CD8+的效應細胞和記憶細胞的百分率 已知CD44+CD62L-的細胞為效應細胞,CD44+CD62L+的細胞為記憶細胞。取小鼠的脾細胞,用流式細胞儀分別檢測CD4+或CD8+的脾細胞中的CD44+CD62L-和CD44+CD62L+的細胞。如表1所示為 CD4+/CD8+的脾細胞中 CD44和CD62L的表達情況,在CD4+的脾細胞中,CpG+G1F/M2(i.n.)和 G1F/M2(i.n.)組的結果相似,均產生了大量的 CD44+細胞(效應細胞),而幾乎沒有CD44+CD62L+雙陽性的細胞;CpG+G1F/M2(i.p.)和CpG+Al+G1F/M2(i.p.)即誘導產生了CD44+單陽性細胞,也產生了CD44+CD62L+雙陽性的細胞(分別為24.9%和16.1%),即記憶細胞。CD8+的脾細胞中CD44和CD62L的表達情況與上述結果類似,CpG+G1F/M2鼻腔免疫組僅產生CD44+單陽性細胞 ,而 CpG+G1F/M2(i.p.)和 CpG+Al+G1F/M2(i.p.)即誘導產生了CD44+單陽性細胞,也產生了CD44+CD62L+雙陽性的細胞(分別為 13.9%和9.9%)。這些結果表明：CpG2216作為鼻腔免疫佐劑未能誘導顯著的免疫記憶,而作為腹腔免疫佐劑則刺激產生了大量的記憶細胞,CpG2216與Al(OH)3聯合使用在誘導記憶應答方面沒有優(yōu)勢。

表1 脾細胞中CD4+/CD8+的效應細胞和記憶細胞百分率Tab.1 Percentage of CD4+/CD8+effector cells or memory cells in spleen cells

3 討論

重組蛋白疫苗對于免疫細胞來說是一種外源性抗原,容易激活體液免疫和經MHCⅡ類途徑激活CD4+Th2細胞應答,不利于誘導細胞毒性T淋巴細胞特異性殺傷活性以及Th1型免疫應答,而機體對病毒感染的防御主要通過激活細胞免疫應答、通過對病毒感染的細胞特異性殺傷來清除病毒。佐劑是指能夠增強和/或調節(jié)抗原的免疫應答的一類物質。近年來,隨著固有免疫細胞的T LR等模式識別受體及其配體病原相關分子模式研究的深入,佐劑科學取得了快速發(fā)展;CpG是T LR9的配體,二者結合后以MyD88依賴的方式激活NF-κB等轉錄因子,上調細胞因子和趨化因子的表達,促進Th0向Th1分化;目前發(fā)現有3中結構不同的CpGODN,分別為A、B、C型。A型ODN含有一個以CG為中心的回文結構5′Pu-Py-CG-Pu-Py3′,3′端具有 polyG 尾巴;CpG2216為A型ODN,研究表明能刺激單核細胞分泌促炎癥細胞因子、Th1型細胞因子以及淋巴細胞毒性作用[4,7,8]。本研究結果表明：CpG2216作為RSV重組疫苗 G1F/M2的佐劑,無論是鼻腔還是腹腔注射免疫均誘導了顯著的特異性殺傷活性和Th1型免疫應答;與以前的研究結果一致。另外,流式細胞檢測技術的結果表明：CpG2216與 G1F/M2混合免疫可顯著增強記憶性免疫應答。Al(OH)3即鋁鹽佐劑,是常用的人用佐劑,能夠吸附大量的蛋白質,具有儲庫作用,近幾年的研究表明鋁鹽佐劑也具有刺激單核細胞等免疫作用,本研究結果顯示CpG2216與Al(OH)3聯合使用能激活更多的分泌IFN-γ和 IL-4的淋巴細胞,且分泌 IFN-γ的淋巴細胞數顯著多于分泌IL-4的淋巴細胞數,提示誘導了Th1型應答,這是一種有利于清除病毒的細胞免疫應答。總之,CpG2216作為RSV重組疫苗 G1F/M2的佐劑,可顯著增強細胞免疫應答,是一種理想的佐劑。

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