周盛華，趙紅宇，朱洪艷，高學(xué)軍，劉曉飛

（1.黑龍江康普生物科技有限公司，哈爾濱 150000；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

牛初乳中sIgA的分離純化

周盛華1，趙紅宇1，朱洪艷1，高學(xué)軍2，劉曉飛2

（1.黑龍江康普生物科技有限公司，哈爾濱 150000；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

為進(jìn)一步開發(fā)利用牛初乳中生物活性物質(zhì)sIgA，有必要建立快速分離純化sIgA的方法。利用凝膠層析和親和層析等技術(shù)進(jìn)行分離sIgA。采用非還原SDS-PAGE和HPLC進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：分離純化的sIgA純度為97.52%，質(zhì)量濃度為5.03 g/L。成功建立了純化牛初乳中sIgA的方法，為實(shí)現(xiàn)sIgA的規(guī)?；a(chǎn)提供參考。

牛初乳；sIgA；純化；檢測(cè)

0 引言

分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A,sIgA）是60年代Tomasi等[1]首先在外分泌液中發(fā)現(xiàn)的一種抗體，主要存在于胃腸液、呼吸道分泌液和乳汁等外分泌液中。研究表明，牛初乳sIgA與人初乳sIgA具有相同的免疫源性[2]，把牛初乳sIgA作為功能性基料添加到嬰幼兒奶粉中，會(huì)在很大程度上提高嬰幼兒的機(jī)體免疫力[3]。本研究建立了實(shí)驗(yàn)室分離提純具免疫活性、較高純度牛初乳sIgA的方法，以期為高純度sIgA工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮牛初乳，superdex 200，TSK-GEL 3000PW色譜柱，proteinG親和層析柱，超濾膜包，兔抗牛sIgA，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒。

高速冷凍離心機(jī)，超濾泵，層析實(shí)驗(yàn)冷柜，核酸蛋白檢測(cè)儀，高效液相色譜儀，酶標(biāo)儀。

1.2 方法

量取新鮮牛初，用4層消毒紗布過濾雜質(zhì)，離心除脂肪，得到的脫脂乳調(diào)pH至4.6，離心除酪蛋白，收集乳清。然后將乳清調(diào)pH值至6.8，加硫酸銨至飽和度達(dá)到33%，離心取沉淀。用生理鹽水溶解沉淀后超濾，收集回流液。將回流液進(jìn)行superdex 200層析，收集各個(gè)峰。將峰2濃縮后進(jìn)行proteinG親和層析，收集流穿峰。最后經(jīng)非還原SDS-PAGE對(duì)sIgA進(jìn)行鑒定；western blot測(cè)定sIgA免疫活性；運(yùn)用HPLC對(duì)sIgA進(jìn)行定量純度檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Superdex200層析

乳清超濾后回流液主要蛋白成分為sIgA，IgM，IgG等大分子量蛋白，經(jīng)superdex 200層析后，得到3個(gè)峰，如圖1所示。經(jīng)非還原SDS-PAGE檢測(cè)各峰，結(jié)果如圖2所示，其中sIgA主要存在于峰2；峰1為IgM和少量IgG；峰3為IgG。

2.2 ProteinG親和層析

收集Superdex 200層析后的峰2，采用Protein G親和層析，收集流穿峰，如圖3所示。圖3中，峰1為流穿的sIgA，峰2是洗脫下來的IgG。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，圖4中，峰1為sIgA的單一條帶。透析濃縮后用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)得sIgA質(zhì)量濃度為5.03g/L。

2.3 sIgA的鑒定

將純化后的產(chǎn)物經(jīng)western blot定性檢測(cè)，如圖5所示，此結(jié)果證實(shí)本試驗(yàn)所存化的sIgA有免疫活性。HPLC檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，sIgA純度為97.52%。

3 討論

目前，牛初乳sIgA的分離純化工藝的研究已有報(bào)道。梁境坤[4]等通過DEAE Sepharose(Fast Flow)離子交換層析和SephadexG-200凝膠層析法得到了濃度為3.45mg/mL的粗提sIgA。劉曉飛[5]等通過DEAE纖維素52和SephadexG-200凝膠層析法分離到純度為75.38%的sIgA。雖然離子交換和凝膠層析可以有效分離sIgA，但很難達(dá)到較高的純度。由于乳清中的IgG等電點(diǎn)為5.5～8.3，sIgA的等電點(diǎn)為7.4，在進(jìn)行離子交換層析時(shí)，會(huì)伴少量IgG一起洗脫下來；IgG二聚體（33 ku）的分子量與sIgA相近（39 ku），在凝膠層析時(shí)IgG二聚體不能與sIgA完全分離。本研究利用分辨率更高的superdex 200凝膠層析和Protein G親和層析技術(shù)有效去除了IgG，得到了純度達(dá)97.52%的牛初乳sIgA，并且有免疫活性。本研究實(shí)現(xiàn)了對(duì)牛初乳sIgA的純化，為進(jìn)一步研發(fā)sIgA ELISA檢測(cè)試劑盒提供標(biāo)準(zhǔn)品和抗體，加快創(chuàng)建我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的sIgA檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)工藝簡(jiǎn)單，易于放大，為牛初乳sIgA的工業(yè)化開發(fā)提供技術(shù)參考；親和層析的成本較高，生產(chǎn)中可根據(jù)產(chǎn)品純度要求選擇分離純化方法。

[1]CHODIRCKER,TOMASI.Simple Separation of Immunoglobulin Fromegg Yolk byUltrafiltration[J].Food Sci.,1998,63(3):485-490.

[2]楊光，王加啟，哈斯額爾敦，等.牛乳中分泌型IgA的合成機(jī)理與提高技術(shù)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2009，36（8）：103-108.

[3]KLINGMULLER D,HILSEHMAN N.Purificaion and Characterization of the Free Secretory Piece of Human Colostrum[J].Hoppe Seylers Z Physiol Chem,1979,360(12):1895-1902.

[4]梁境坤，王繼芳，曹榮峰，等.奶牛初乳SIGA的提純與電泳分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（15）：6-8.

[5]劉曉飛，高學(xué)軍，姚永豪，等.牛初乳sIgA分離純化及其檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，39（10）：131-135.

Isolation and purification of sIgA from bovine colostrum

ZHOU Sheng-hua1,ZHAO Hong-yu1,ZHU Hong-yan1,GAO Xue-jun2,LIU Xiao-fei2
（1.Heilongjiang Kanpure Biotechnology Co.Ltd.，Harbin 150000，China；2.Key Laboratory of Dairy Science Ministry of Education Northeast Agricultural University,Harbin 150030，China）

To further utilize bioactive substance such as bovine colostrum sIgA,a fast isolation and purification technique was established by gel chromatography and affinity chromatography et al.The product was detected by non-hydrogenize SDS-PAGE and HPLC.The result showed that the purity of sIgA was 97.52%and the concentration was 5.03 mg/mL.The method was successly established for purifying sIgA from bovine colostrum,and provided reference for industrial production.

Bovine Colostrums;sIgA;purification;detect

TS252.1

A

1001-2230（2011）06-0012-02

2010-11-08

周盛華（1981-），男，碩士，主要從事蛋白純化研究。

趙紅宇