其木格蘇都，王記成，張家超，張和平

（1.青島君益食品有限公司，山東 青島 266107 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018）

熒光定量PCR法檢測(cè)益生菌飲料中Lactobacillus casei Zhang和Bifidobacterium lactis V9

其木格蘇都1，王記成2，張家超2，張和平2

（1.青島君益食品有限公司，山東 青島 266107 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018）

益生菌活菌數(shù)是益生菌產(chǎn)品最重要的指標(biāo)，而檢測(cè)益生菌方法的準(zhǔn)確性和科學(xué)性則至關(guān)重要。本文采用熒光定量PCR法同時(shí)定量檢測(cè)益生菌飲料中Lactobacillus casei Zhang（L.casei Zhang）和Bifidobacterium lactis V9（B.lactis V9）的活菌數(shù)，并與平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行比較。結(jié)果表明，熒光定量PCR法測(cè)得L.casei Zhang活菌數(shù)與平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)得活菌數(shù)差異不顯著；而采用熒光定量PCR法測(cè)得B.lactis V9活菌數(shù)顯著高于平板菌落計(jì)數(shù)法。熒光定量PCR法靈敏、特異、簡(jiǎn)便快速，可定量檢測(cè)并真實(shí)反應(yīng)L.casei Zhang和B.lactis V9的活菌數(shù)。

熒光定量PCR；菌落計(jì)數(shù)

0 引 言

益生菌在產(chǎn)品中的存活與否及其存活的數(shù)量是其發(fā)揮生理功效的前提。準(zhǔn)確科學(xué)的檢測(cè)其活菌數(shù)至關(guān)重要。熒光定量PCR方法檢測(cè)多菌復(fù)合發(fā)酵樣品中特定菌株，檢測(cè)效率高，特異性和敏感性強(qiáng)，已經(jīng)被應(yīng)用于乳酸菌的定量研究中[1]。

Lactobacillus caseiZhang（L.caseiZhang）分離自傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶（koumiss）[2]。大鼠和小鼠模型試驗(yàn)、人體試驗(yàn)以及基因組學(xué)和蛋白組學(xué)試驗(yàn)研究顯示，L.casei Zhang具有良好的益生特性[3-9]。Bifidobacterium lactis V9（B.lactis V9）分離自健康蒙古族兒童糞便中[10]。臨床研究表明，其對(duì)便秘和急慢性腹瀉患者治療效果顯著[11]。

本文以L.casei Zhang和B.lactis V9雙聯(lián)益生菌共生發(fā)酵制得的豆乳飲料——百益多為樣本，采用熒光定量PCR法檢測(cè)二者的活菌數(shù)，并與平板菌落計(jì)數(shù)法比較，探尋更準(zhǔn)確適合的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

樣品：瓶裝“百益多”活性益生菌豆乳飲料。

藥品：TaKaRa-PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser（大連寶生物RNA反轉(zhuǎn)錄純化試劑盒）和TransStart Green qPCR SuperMix（北京全式金熒光定量試劑），GB 4789.35—2010乳酸菌檢驗(yàn)中所述試劑。

儀器：Eppendorf 5810高速冷凍離心機(jī)，ND-100微量紫外分光光度計(jì)，AB-Veriti PCR儀，ABStepOne熒光定量PCR儀，GB 4789.35—2010乳酸菌檢驗(yàn)中所述儀器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

取連續(xù)生產(chǎn)3批產(chǎn)品，隨機(jī)抽取3瓶樣品進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 熒光定量PCR法

（1）RNA的提取及純化。將供試樣品搖勻后吸取1 mL液體移入離心管中離心收集菌體。之后按照Trizol試劑盒說明書提取樣品RNA，檢測(cè)RNA純度和濃度后，應(yīng)用TaKaRa試劑盒于42℃水浴鍋中恒溫處理2 min去除基因組DNA，最后將純化的RNA貯存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

（2）RNA的反轉(zhuǎn)錄。以提取純化的總RNA為模板，使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將混勻的反應(yīng)液放置在PCR儀中37℃保溫15 min而后85℃加熱7 s最后將反轉(zhuǎn)錄成的cDNA降溫至4℃保藏。

（3）特異性引物的篩選。以L.casei Zhang全基因組序列為依據(jù)，選取其中一段特異性片段設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用該引物擴(kuò)增Lactobacillus casei參考菌株，特異性引物信息見圖1。參照以往試驗(yàn)及文獻(xiàn)[12]，設(shè)計(jì)雙歧桿菌屬的特異性引物，引物序列為Bifid-F CTCCTGGAAACGGGTGG；Bifid-RGGTGTTCTTCCCGATATCTACA。

（4）標(biāo)準(zhǔn)品的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。標(biāo)準(zhǔn)品的制備：提取L.casei Zhang和B.lactis V9的宏基因組DNA，應(yīng)用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，根據(jù)已知L.casei Zhang和B.lactis V9的基因組片段長(zhǎng)度，依據(jù)拷貝數(shù)計(jì)算公式計(jì)算出單位濃度的基因組DNA中所包含的L.casei Zhang和B.lactis V9的個(gè)數(shù)，將此單位濃度的基因組DNA進(jìn)行10倍系列稀釋并以此作為外標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以含有梯度稀釋個(gè)數(shù)的L.casei Zhang和B.lactis V9宏基因組DNA陽性模板的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)過程中到達(dá)熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)（Ct）為縱坐標(biāo)擴(kuò)增得到L.casei Zhang和B.lactis V9的定量擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此作為待測(cè)樣品中L.casei Zhang和B.lactis V9數(shù)量測(cè)定的參照標(biāo)準(zhǔn)。

（5）活菌數(shù)的測(cè)定。以待測(cè)樣品反轉(zhuǎn)錄的cDNA和標(biāo)準(zhǔn)品為模板，用L.casei Zhang和B.lactis V9特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)參數(shù)為：95℃（20 s）；40個(gè)循環(huán)，95℃（5 s），65℃（30 s），72℃（40 s）。 將擴(kuò)增結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)計(jì)算出每毫升樣品中L.casei Zhang和B.lactis V9的活菌數(shù)。

1.2.3 平板菌落計(jì)數(shù)方法

具體方法見GB 4789.35-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

3個(gè)平行試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS ANOVA程序處理，P＜0.05。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 熒光定量PCR法測(cè)定

2.1.1 樣品中RNA提取

從“百益多”中提取的RNA經(jīng)電泳檢測(cè)后如圖2所示，從圖中可以看出總RNA 3條帶清楚分明，亮度較強(qiáng)，純度較高。完全滿足后續(xù)試驗(yàn)需求。

2.1.2 L.casei Zhang和B.lactis V9熒光定量擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線

以梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行熒光定量PCR，繪制的L.casei Zhang和B.lactis V9熒光定量擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程分別為：Y=-2.914x+40.211（R2=0.998） 和Y=-3.461x+47.627（R2=0.999）。該標(biāo)準(zhǔn)曲線R值分別為0.998和0.999，精確度較高，因此該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以作為待測(cè)樣品中L.casei Zhang和B.lactis V9數(shù)量測(cè)定的參考依據(jù)。

2.1.3 L.casei Zhang和B.lactis V9活菌數(shù)檢測(cè)

以每毫升“百益多”中反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR，將熒光定量的結(jié)果和L.casei Zhang及B.lactis V9擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)后計(jì)算出每毫升“百益多”中所含有的L.casei Zhang和B.lactis V9活菌數(shù)，結(jié)果見表1。結(jié)果測(cè)得L.casei Zhang活菌數(shù)為（1.2±0.07）×109mL-1，B.lactis V9活菌數(shù)為（1.5±0.10）×109mL-1。

2.2 平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定

采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)得2株益生菌活菌數(shù)見表1。3個(gè)平行樣品，選取適宜稀釋梯度，每個(gè)梯度涂布2個(gè)平板，結(jié)果取平均值，測(cè)得樣品中L.casei Zhang活菌數(shù)為（9.1±0.17）×108mL-1，B.lactis V9活菌數(shù)為（6.5±0.09）×108mL-1。

表1 百益多飲料中L.casei Zhang和B.lactis V9活菌數(shù)測(cè)定結(jié)果CFU·mL-1

3 討 論

本研究中采用熒光定量PCR法，對(duì)活性益生菌豆乳飲料“百益多”中2株益生菌L.casei Zhang和B.lactis V9的活菌數(shù)進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)以平板菌落計(jì)數(shù)方法進(jìn)行了對(duì)比檢測(cè)。熒光定量PCR法測(cè)得L.casei Zhang活菌數(shù)為 （1.2±0.07）×109mL-1，B.lactis V9活菌數(shù)為（1.5±0.10）×109mL-1， 平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)得活菌數(shù)分別為（9.1±0.17）×108mL-1和（6.5±0.09）×108mL-1。 兩種方法檢測(cè)的L.casei Zhang活菌數(shù)差異不顯著 （P＜0.05），但是采用熒光定量PCR法測(cè)得的B.lactis V9活菌數(shù)顯著高于平板計(jì)數(shù)法（P＜0.05）。雙歧桿菌為專性厭氧菌，操作過程中，環(huán)境中的氧氣可能會(huì)導(dǎo)致部分雙歧桿菌死亡，進(jìn)而影響活菌數(shù)的準(zhǔn)確性[1]，另外，平板菌落計(jì)數(shù)是以選擇性培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的，選擇性培養(yǎng)基成分較復(fù)雜，常以一定濃度抗生素來選擇計(jì)數(shù)目標(biāo)菌[13-14]。本文采用熒光定量PCR法計(jì)數(shù)B.lactis V9，其活菌數(shù)是平板菌落計(jì)數(shù)法（MRS固體培養(yǎng)基中添加一定濃度的抗生素莫匹羅星）的2.3倍。

益生菌活菌數(shù)的準(zhǔn)確數(shù)量受其所在載體、其自身活力、應(yīng)激狀態(tài)及所在產(chǎn)品生產(chǎn)條件等因素影響。應(yīng)激狀態(tài)下的菌體細(xì)胞，在液體培養(yǎng)基中較固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好[15]，這可能是本研究中平板計(jì)數(shù)法活菌數(shù)較低的原因之一。研究表明，雙歧桿菌在乳制品生產(chǎn)發(fā)酵過程中會(huì)聚集形成菌團(tuán)，采用平板菌落計(jì)數(shù)法對(duì)此發(fā)酵產(chǎn)物中雙歧桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，此菌團(tuán)在固體培養(yǎng)基上形成單個(gè)菌落，而不是單個(gè)細(xì)胞形成的菌落，由此造成實(shí)際數(shù)量偏低[15]，這也可能是本研究中平板計(jì)數(shù)法活菌數(shù)較低的另一原因。另外，本研究所用抗生素選擇計(jì)數(shù)目標(biāo)菌B.lactis V9，菌體活力及數(shù)量對(duì)抗生素濃度的敏感程度不同，可能對(duì)活菌數(shù)造成一定影響。

通過提取RNA再發(fā)轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后用熒光定量PCR檢測(cè)樣品中活菌數(shù)，此方法已應(yīng)用于發(fā)酵乳制品和益生菌制品中乳酸菌的定量檢測(cè)，大量研究結(jié)果表明此方法檢測(cè)乳酸桿菌，快速、靈敏而且特異性較高[16-17]。因此，采用熒光定量PCR法計(jì)數(shù)更能真實(shí)的反應(yīng)“百益多”中L.casei Zhang和B.lactis V9的活菌數(shù)。

4 結(jié) 論

本文以平板菌落計(jì)數(shù)法為對(duì)照，通過熒光定量PCR法，檢測(cè)活性益生菌豆乳飲料“百益多”中2株益生菌L.casei Zhang和B.lactis V9的活菌數(shù)。結(jié)果表明熒光定量PCR法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)結(jié)果可靠性好，穩(wěn)定性高，可真實(shí)反應(yīng)檢測(cè)樣品中L.casei Zhang和B.lactis V9的活菌數(shù)。

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Lactobacillus casei Zhang Bifidobacterium lactis V9 Method of fluorescent quantitative PCR for detection of Lactobacillus casei Zhang and Bifidobacterium lactis V9

Qimugesudu1,WANG Ji-cheng2,ZHANG Jia-chao2,ZHANG He-ping2
（1.Qingdao Junyi Food Co.Ltd.,Qingdao 266107,China 2.Key Lab of Dairy Biotechnology and Bioengineer of Education Ministry of China,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China）

The viable count of probiotic is considered as the most important index and the accurate and scientific assay of probiotic viable number is essential to probiotic products.In the present study,the fluorescent quantitative PCR method and plate colony counting method were used and compared for detection of bacterial viable numbers of Lactobacillus casei Zhang and Bifidobacterium lactis V9 in probiotic fermented beverage.The result showed that there was no significant difference of L.casei Zhang number between two methods,whereas the numbers of B.lactis V9 detected by two methods were significant difference.It is suggested that fluorescent quantitative PCR method appear to be highly accurate,specific,fast and reliable for quantification of L.casei Zhang and B.lactis V9.

Fluorescent quantitative PCR;colony counting;Lactobacillus casei Zhang;Bifidobacterium lactis V9

TS252.7

A

1001-2230（2011）12-0031-03

2011-10-08

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863項(xiàng)目，2011AA100901，

2011AA100902）。

其木格蘇都（1983-）女,工程師,從事乳制品科學(xué)方面的研究。

張和平