胡連霞

（河北出入境檢驗(yàn)檢疫局，石家莊 050051）

應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測阪崎腸桿菌

胡連霞*

（河北出入境檢驗(yàn)檢疫局，石家莊 050051）

建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測阪崎腸桿菌的方法，通過肉眼可見的白色沉淀，判斷檢測結(jié)果。將阪崎腸桿菌（ATCC29544）的16S-23SrRNA間區(qū)序列作為靶基因，設(shè)計(jì)2對(duì)特異引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析，與理論上的預(yù)期結(jié)果相一致。通過測序比對(duì)，與GenBank上報(bào)道的同源性達(dá)到99%。用25株食源性致病菌證實(shí)該引物特異性強(qiáng)。LAMP擴(kuò)增20min，其靈敏度為4.3×102fg/tube，結(jié)果表明，LAMP方法檢測阪崎腸桿菌，靈敏度高、特異性強(qiáng)、耗時(shí)短、方法簡便。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；LAMP；檢測；阪崎腸桿菌

阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii，E.sakazakii）是腸桿菌科中無芽孢而呈棒狀的革蘭氏陰性桿菌，為條件致病菌。阪崎腸桿菌能在很寬的溫度范圍內(nèi)生長（6℃～47℃），比其他腸桿菌科細(xì)菌生長范圍更寬，而且遲滯時(shí)間和時(shí)代更短。2004年初，聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織在日內(nèi)瓦召開的專家咨詢會(huì)，指出嬰兒配方粉中即使只存在微量的阪崎腸桿菌污染（＜3 CfU/100g） 也能導(dǎo)致感染的發(fā)生。因此，建立靈敏、特異的檢測方法尤為重要。

目前，阪崎腸桿菌傳統(tǒng)檢測方法和免疫學(xué)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、靈敏度較低。2004年，F(xiàn)AO/WHO召開了兩次國際相關(guān)會(huì)議，建議采用國際通用的分子生物學(xué)方法檢測阪崎腸桿菌，來彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的缺陷。分子檢測方法如PCR，靈敏、快速，但對(duì)操作、設(shè)備條件、工作環(huán)境均有較高的要求，仍不能進(jìn)行廣泛的普及和推廣。

2000年，日本榮研化學(xué)株式會(huì)的Notomi T等開發(fā)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP） 是一種新的核酸擴(kuò)增方法，其基本原理是對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異的引物，在一種鏈置換DNA聚合酶作用下，恒溫（65℃左右） 幾十分鐘，即可擴(kuò)增靶DNA片段達(dá)109～1010數(shù)量級(jí)。DNA在高效延伸合成的同時(shí)，會(huì)生成相應(yīng)大量焦磷酸鎂的衍生物，即呈現(xiàn)肉眼可見的白色沉淀。只要用肉眼觀察白色混濁沉淀，就能判斷擴(kuò)增與否。因此，LAMP方法因其不依賴于昂貴的PCR儀和試劑，使其更利于在基層機(jī)構(gòu)的推廣和應(yīng)用，從而將成為取代PCR的核酸擴(kuò)增新技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

阪崎腸桿菌（Enterobactersakazakii）：ATCC29544、ATCC51007、ATCC51024；大腸桿菌 O157：H7（E.coli O157： H7）： ATCC43889、 IQCL10102、EDL933、CMCC44828；大腸艾希氏菌（E.coli）：CGMCC11229；沙門氏菌（salmonella）：CMCC47005、CMCC50047、CMCC50083、CMCC50104、CMCC50 001、CMCC50004；痢疾志賀氏菌（Shigella dysente riae）：CMCC51054；福氏志賀氏菌（Shigellaflexneri）：CMCC51061；鮑氏志賀氏菌（Shigella boydii）：CM CC51149、CMCC51522；單核細(xì)胞增生李斯特菌（L.monocytogenes）：ATCC7644、CMCC54001；金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）：CGMCC26003；蠟樣芽孢桿菌 （Bacillus cereus）：ATCC7064、CMCC63302；綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）：CMCC10104；小腸結(jié)腸炎耶爾森桿菌（Enterobacte yersinia）：CMCC52302；普通變形桿菌（Proteus vuLgaris）：CMCC49027；產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens）：CICC22949、CMCC64609。

菌株來源：ATCC由美國菌種保藏中心提供；IQCL由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院提供；EDL和CMCC由中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心提供；CGMCC和CICC由中國工業(yè)微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 試劑

BstDNA聚合酶：NewEngland Biolabs；Taq DNA聚合酶、dNTP、10×Loading buffer、DNA Marker DL100、DL2000、LAMP引物合成等：上海生工生物工程有限公司；DNA試劑盒：Bio Basic Inc.；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯等：北京路橋公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋；SIGMA3K30高速冷凍離心機(jī)；Whatman TGradient PCR擴(kuò)增儀；LRH-150B恒溫培養(yǎng)箱；KodakEDAS290凝膠成像系統(tǒng)；DXY-33A型電泳儀；0.5～1000LlBIOHIT微量移液器。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)菌株純培養(yǎng)

3株阪崎腸桿菌菌株和25株食源性致病菌菌株接種于新鮮無菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h。從培養(yǎng)液中各取1 mL直接用試劑盒法提取各菌基因組DNA，進(jìn)行Lamp和PCR試驗(yàn)。

1.3.2 模板DNA的制備

按照DNA試劑盒的說明進(jìn)行，提取的DNA，溶解于100 μL的洗脫緩沖液中，并儲(chǔ)存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 模板DNA含量的確定

根據(jù)測定模板DNA稀釋105倍后的OD260讀數(shù)，計(jì)算DNA含量為2.15×1011fg/μL。

1.3.4 LAMP引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Genebank中的阪崎腸桿菌基因序列，進(jìn)行比對(duì)，確定阪崎腸桿菌（ATCC29544）在GenBank中（基因號(hào)為AY702093）16S-23SrRNA間區(qū)序列為保守序列。利用軟件（https：//primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html）在線設(shè)計(jì)4條LAMP引物：兩條外引物 F3 （5’-CGGTTGGATCACCTCCTTAC-3’） 和 B3（5’-CGGTAACGCCTTTCACTCAT-3’），兩條內(nèi)引物FIP （ 5’-CTTCGCTTTCGCAGACAACCCTTCGCG TGCTCACACAGAT-3’）和 BIP（5’-TTCGTCTAGA GGCCCAGGACACTTAGGGGATTCGAACC-3’），擴(kuò)增基因組中的位置從125至327區(qū)域203 bp基因片段。各引物在基因組中的位置及設(shè)計(jì)的HinfⅠ酶切位點(diǎn)如下頁圖1所示。對(duì)GenBank中阪崎腸桿菌（基因號(hào)AY702093）16 s～23 s RNA間區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，由正向序列F2和F1的一個(gè)互補(bǔ)序列構(gòu)成FIP，由正向序列B2和B1的一個(gè)互補(bǔ)序列構(gòu)成BIP，方塊表示相應(yīng)目的基因序列上的HinfⅠ酶切位點(diǎn)。

1.3.5 LAMP和PCR反應(yīng)體系

圖1 每條引物在基因組中的位置及設(shè)計(jì)的HinfⅠ酶切位點(diǎn)

LAMP反應(yīng)體系：外引物各0.2 μmol/L、內(nèi)引物各 1.6 μmol/L、2.5 μmol/L dNTP、1.6 mol/L Sigma 甜菜堿、4 μmol/LMgSO4、10×Bst DNA 聚合酶反應(yīng)緩沖液，8U的Bst DNA聚合酶大片段、2 μL DNA模板，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足25 μL。

PCR反應(yīng)體系：上下游引物各10 μmol/L、2.5 μmol/L dNTP、10×聚合酶鏈反應(yīng)緩沖液（Mg2+Free）、25 μmol/L MgCl2、5U 的 Taq DNA聚合酶、2 μL DNA模板，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足25 μL。

1.3.6 LAMP和PCR反應(yīng)程序

LAMP體系64℃水浴加熱20 min，然后80℃水浴加熱10 min后，觀察有無白色沉淀，判斷檢測結(jié)果。同時(shí)，取LAMP產(chǎn)物5 μL與1 μL的lodding buffer混合均勻，1.5 g/100g瓊脂糖凝膠電泳后，觀察梯形條帶，用以證實(shí)是否發(fā)生了LAMP反應(yīng)。

PCR反應(yīng)體系預(yù)變性95℃、5min，變性95℃、45 s；退火57℃、30 s；延伸72℃、30 s。35個(gè)循環(huán)。

1.3.7 LAMP產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析

為了確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，擴(kuò)增產(chǎn)物被HinfⅠ酶切。10U的 HinfⅠ、10×HBuffer、8 μLLAMP 產(chǎn)物和滅菌雙蒸水補(bǔ)足20 μL的反應(yīng)體系。于37℃恒溫 24 h后，取酶切產(chǎn)物 5 μL，與 1 μL的 lodding buffer混合均勻，2 g/100g瓊脂糖凝膠電泳后，觀察結(jié)果。

1.3.8 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析

PCR引物是檢測阪崎腸桿菌的LAMP方法的兩條外引物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)上海生工生物技術(shù)有限公司測序，測定的序列在GenBank上與文獻(xiàn)報(bào)道的靶基因序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP產(chǎn)物的可視結(jié)果

LAMP反應(yīng)擴(kuò)增大量核酸的同時(shí)，產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物——肉眼可見的白色焦磷酸鎂沉淀，如圖2所示，通過肉眼觀察白色沉淀，判斷檢測結(jié)果。管1，陽性結(jié)果，由于DNA的大量擴(kuò)增，在陽性的反應(yīng)混合物中產(chǎn)生肉眼可見的白色焦磷酸鎂沉淀；管2，陰性對(duì)照，用滅菌的雙蒸水代替DNA模板參加LAMP反應(yīng)。

圖2LAMP的可視結(jié)果

2.2 LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物酶切分析結(jié)果

預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)構(gòu)如圖3所示。第一和第四行中顯示HinfⅠ限制性酶切位點(diǎn)和酶切片段的大??；第二和第三排顯示B+、B-、F+和F-結(jié)構(gòu)的DNA大小；+是目標(biāo)序列B1和F1c之間的距離；-是+的互補(bǔ)序列。由圖1和圖3計(jì)算可知，LAMP引物設(shè)計(jì)的HinfⅠ酶切位點(diǎn)主要產(chǎn)生200 bp-、178 bp-、156 bp-片段和少量29 bp-、32 bp-片段。LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶HinfⅠ消化，電泳結(jié)果如圖4所示，與理論上的預(yù)期值相符。泳道1：LAMP擴(kuò)增阪崎腸桿菌陽性產(chǎn)物；泳道2：陰性對(duì)照；泳道3：HinfⅠ酶切陽性產(chǎn)物結(jié)果（片段200 bp-，178 bp- 和 156 bp-）；泳道 M：100 bp laddermarker。

圖3 預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)示意圖

圖4 LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物酶切分析

2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序比對(duì)結(jié)果

采用外引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到203 bp左右目的片段，經(jīng)上海生工生物技術(shù)有限公司測序，測定的序列在GenBank上與報(bào)道的靶基因序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果見圖5所示，Query表示提交的序列，Sbjct表示blast到的AY70 2093序列。與AY702093基因序列同源性達(dá)到99%。該片段能作為特異性基因序列來設(shè)計(jì)引物，以建立阪崎腸桿菌種特異性分子檢測技術(shù)。

2.4 LAMP引物的特異性

對(duì)3株阪崎腸桿菌菌株（ATCC29544、ATCC 51007、ATCC51024） 和25株其他腸道致病菌特異性檢測結(jié)果如表1所示。LAMP檢測所有阪崎腸桿菌菌株都能產(chǎn)生特異擴(kuò)增的梯形條帶，有白色沉淀，呈陽性結(jié)果；其余25株其他腸道致病菌均未產(chǎn)生特異擴(kuò)增的梯形條帶，無白色沉淀，呈陰性結(jié)果。

圖5 PCR產(chǎn)物測定的序列與GenBank中目的基因序列的比對(duì)結(jié)果

2.5 LAMP檢測方法的靈敏性

用洗脫緩沖液進(jìn)行100～1011系列稀釋基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定，得到DNA含量為 2.15×1011fg/μL，依次取倍比稀釋 DNA2 μL作為模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)，擴(kuò)增20 min，靈敏度達(dá) 4.3×102fg/tube。

3 討 論

近年來，阪崎腸桿菌的檢測方法取得重要進(jìn)展，針對(duì)保守序列如16SrRNA、23S rRNA和16S-23SrRNA間區(qū)序列（ITS） 等的分子檢測技術(shù)也相繼建立。LAMP方法作為一種新的恒溫核酸擴(kuò)增方法，由4條引物識(shí)別靶基因的6個(gè)特定區(qū)域，從而增強(qiáng)了方法的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，和其他核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，不需要模板的熱變性、長時(shí)間溫度循環(huán)、昂貴的精密儀器，尤其是反應(yīng)結(jié)果直接通過肉眼觀察是否產(chǎn)生白色沉淀（混濁）來判斷，可以省去繁瑣的電泳、紫外觀察、凝膠成像等過程，從而大大縮短了檢測時(shí)間，節(jié)約了人力和物力。本研究從阪崎腸桿菌16S-23SrRNA間區(qū)序列上找到一段相對(duì)保守序列，建立的阪崎腸桿菌的LAMP檢測方法，切實(shí)可行，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、簡便的優(yōu)點(diǎn)，有關(guān)純培養(yǎng)的陽性菌株與陽性樣品之間是否存在差異，需要大量累積檢測數(shù)據(jù)，有待于我們下一步的深入研究。今后將LAMP應(yīng)用于實(shí)際樣品食源性致病菌的快速檢測具有廣闊的應(yīng)用前景。

表1 LAMP引物的特異性

［1］FARMER J J III，ASBURY M A，BRENNER D J，et al.Enterobacter sakazakii：a new species of“Enterobacteriaceae”isolated from clinical specimens［J］.Int J System Bacteriol，1980，30：569-584.

［2］NAZAROWEC WM，F(xiàn)ARBER JM.Incidence，survival and growth of Enterobacter sakazakii in infant formula［J］.Journal of Food Protection，1997，60：226-230.

［3］FAO/WHO.Draft risk assessement for Enterobacter sakazakii［J/OL］.http/www.who.int/foodsafety/publications/micro/mra6.Accessed，2004-5-2.

［4］吳清平，葉應(yīng)旺，郭偉鵬，等.阪崎腸桿菌的生物學(xué)特性及其檢測技術(shù)［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2006，33（6）：99-103.

［5］NOTOMI T，OKAYAMA H，MASUBUCHI H，et al.Loopmediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Res，2000，28（12）：E63.

［6］MORI Y，NAGAMINE K，TOMITA，et al.Detection of loopmediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，289：150-154.

［7］肖斌，朱永紅，鄒全明.簡便敏感的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因診斷新技術(shù)［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2005，28（7）：761-763.

［8］KATOH，YOSHIDA A，ANSAI T，et al.Loop-mediated isothermal amplification method for the rapid detection of Enterococcus faecalis in infected root canals［J］.Oral Microbiol Immunol，2007，22（2）：131-135.

［9］YUKIKO HK，NEMOTO J，OHTSUKA K，et al.Sensitive and rapid detection of Vero toxin-producing Escherichia coilusing loop-mediated isothermal amplification［J］.Journal of Medical Microbiology，2007，56：398-406.

［10］LEUSCHER RGK，BAIRD F，DONALD B，et al.A medium for the p resumptive detection of Enterobacter sakazakii in infant formula［J］.Food Microbiol，2004，21（5）：527-533.

［11］IVERSEN C，DRUGGAN P，F(xiàn)ORSYTHE S.A selective differential medium for Enterobacter sakazakii［J］.Int J Food Microbiol，2004，96（2）：133-139.

［12］NAGAMINE K，WATANAGE K，OHTSUKA K，et al.Loopmediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template［J］.Clin Chem，2001，47：1 742-1 743.

［13］KAYOKO O，KEIKO Y，KOSUKE T，et al.Detection of salmonella enteric in naturally contaminated liquid eggs by loop-mediated isothermal amplification and characterization of Salmonella Isolates［J］.Journal of clinical microbiology，2004，71（11）：6 730-6 735.

Application of loop-mediated isothermal amplification detection of nterobacter sakazakii

HULian-Xia*
（Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shijiazhuang 050051，China）

Establish a loop-mediated isothermal amplification method for detection of the Enterobacter sakazakii，through white precipitates viewed with the naked eye to determine test results.The sequences of 16S-23Sr RNA of Enterobacter sakazakii（ATCC29544） was as target gene，2 pairs ofspecifical primers were designed.Byoptimization of reaction conditions，the sequences were amplificated by LAMP.Detection of Enterobacter sakazakii strains by LAMP was positive.The positive products were digested with restriction enzyme，which the theoretical expected results are consistent with.the result of sequencing of PCR with the outer primers of LAMP was compared with gene sequences in GenBank and reached the reported 99%homology.Specificity of the LAMP primers was confirmed using 25 strains of food borne pathogens.The sensitivity of the LAMP was 4.3×102fg for 20 min.The results showed that，LAMP method for detection ofEnterobacter sakazakii was high sensitivityand specificity，shorter time-consumingand simple.

loop-mediated isothermal amplification；LAMP；detection；enterobacter sakazakii

TS252.2

A

1673-6004（2011）02-0036-04

* 胡連霞，女，1972年出生，2009年畢業(yè)于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)科技學(xué)院微生物專業(yè)，工程師。

2011-04-17