劉嘉俊 李汴生

（1華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣州 510641） （2廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，廣州 510300）

固定化木瓜蛋白酶的研究進(jìn)展

劉嘉俊1，2*李汴生1

（1華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣州 510641） （2廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，廣州 510300）

木瓜蛋白酶具有水解蛋白質(zhì)能力強(qiáng)的特點(diǎn)，但游離的木瓜蛋白酶穩(wěn)定性差，難以回收利用；固定化木瓜蛋白酶既保持了酶的催化性質(zhì)，又克服了游離酶的不足，具有廣泛的發(fā)展前景。

木瓜蛋白酶；固定化；應(yīng)用

1 木瓜蛋白酶及其固定化應(yīng)用

木瓜蛋白酶別名為木瓜酶，純木瓜蛋白酶是有由212個(gè)氨基酸組成的單鏈蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量為23 406。制品可含有木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶和溶菌酶等不同的酶，為乳白色至微黃色粉末，具有木瓜特有的氣味，稍具有吸濕性。水解蛋白質(zhì)能力強(qiáng)，但幾乎不能分解蛋白胨。最適作用溫度65℃，最適作用pH為5.0，易溶于水、甘油，不溶于一般的有機(jī)溶劑，等電點(diǎn)為pH8.75。

雖然木瓜蛋白酶具有催化能力強(qiáng)，作用底物專一，反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，但穩(wěn)定性差，在溫度、pH和無(wú)機(jī)離子等外界因素影響下，容易變性失活，而且木瓜蛋白酶一般都是在水溶液中與底物反應(yīng)，這樣酶在反應(yīng)系統(tǒng)中，與底物和產(chǎn)物混在一起，反應(yīng)結(jié)束后，即使酶仍有較高活力，也難以回收利用。這種一次性使用酶的方式，不僅成本較高，而且難以連續(xù)化生產(chǎn)。因此，近年來(lái)一直在研究固定化木瓜蛋白酶技術(shù)，人們?cè)噲D用固定化的方法使木瓜蛋白酶固定在載體上，并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)。固定化酶既保持了酶的催化活性，又克服了游離酶的不足，具有增加穩(wěn)定性、可反復(fù)或連續(xù)使用以及易于和反應(yīng)產(chǎn)物分開等顯著優(yōu)點(diǎn)。

2 木瓜蛋白酶固定化的基本原理

酶的固定化方法有吸附法、包埋法、交聯(lián)法等，這些方法各有利弊。載體材料作為固定化酶的重要部分，其結(jié)構(gòu)和性能對(duì)固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)有很大的影響，因此很多學(xué)者一直致力于對(duì)載體的研究，以求獲得適合于某種酶的價(jià)格低廉的載體，以及操作簡(jiǎn)便和酶活力回收更高的固定化方法。

3 木瓜蛋白酶的固定化技術(shù)

3.1 吸附法

近年的研究中關(guān)于木瓜蛋白酶的固定化技術(shù)使用較多的是吸附法，吸附法主要有物理吸附法和離子交換吸附法兩種。物理吸附法是以比表面積較大的物質(zhì)為載體（無(wú)機(jī)載體如活性氧化鋁、活性碳、皂土、硅藻土、高嶺土、多孔玻璃、硅膠，二氧化鈦等；有機(jī)載體如面筋、淀粉、纖維素、膠原、塞璐璐和火棉膠等），其特點(diǎn)是吸附作用選擇性不強(qiáng)，吸附不牢，還會(huì)引起吸附變性。離子交換吸附法是以DEAE-纖維素、CM-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等為載體。2005年，高波等首次利用冷凍-真空吸附法在介孔材料SBA-15中固定了木瓜蛋白酶，與普通的浸漬方法相比，此法不僅可以制備高祖裝量的固定化酶，每克載體固定量可達(dá)450 mg，同時(shí)酶的活性仍然保持，并得到較好的固定化酶性質(zhì)（如高穩(wěn)定性），在90℃保溫30 min仍可保留70%的活力。2005年，沈斌等提出酶的“柔性固定化”模型，并以Mannich反應(yīng)得到單載量為0.4 mmol NH2/g～6.0 mmol NH2/g的胺化苯聚乙酰樹脂為載體，以雙醛淀粉為柔性鏈，對(duì)木瓜蛋白酶進(jìn)行柔性固定化，酶活回收率可達(dá)40%～50%，相當(dāng)于手臂固定化酶活力率的1.8～2.4倍，且柔性固定化酶穩(wěn)定性較好，該結(jié)果說(shuō)明，酶的“柔性固定化”模型可以改善傳統(tǒng)共價(jià)結(jié)合固定化及手臂固定化酶活力回收率不高的缺陷。2007年，王安明等通過(guò)超聲條件下硅酸四乙酯與γ-氨丙基三乙氧基硅烷的同步水解，一步制備了帶氨基的二氧化硅微球，并在其表面沉積了銀納米粒子，以此負(fù)載銀的二氧化硅微球作為載體固定木瓜蛋白酶，研究了銀納米粒子負(fù)載量對(duì)木瓜酶固定化的影響，考察了固定化木瓜蛋白酶的性能，結(jié)果表明，當(dāng)載體的銀負(fù)載量為0.68 g/100g時(shí)，固定木瓜蛋白酶活回收率達(dá)到最高，比使用未負(fù)載銀的載體提高了188%。該固定酶比游離酶具有更好的熱穩(wěn)定性，在重復(fù)使用20次后仍保持原有酶活的43%，4℃下儲(chǔ)存2個(gè)月后酶活基本沒有下降。

3.2 包埋法

包埋法是用物理或化學(xué)的方法把酶包埋在水不溶性凝膠或半透膜的微囊體中制成的。酶固定化后一般穩(wěn)定性增加，易從反應(yīng)系統(tǒng)中分離，且易于控制，能反復(fù)多次使用，便于運(yùn)輸和貯存，有利于自動(dòng)化生產(chǎn)。2001年，李紅等研究了以殼聚糖微球?yàn)檩d體固定化木瓜蛋白酶的特性，包括其形態(tài)、外觀和酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明：殼聚糖微球固定化木瓜蛋白酶是粒徑分布范圍較均勻的球形微粒，固定化酶的表觀米氏常數(shù)Kmapp（酪蛋白） 為0.055%，是溶液酶米氏常數(shù)Km的0.13倍，最適pH為8.0，pH穩(wěn)定性在7.0左右，熱穩(wěn)定性在15℃～35℃范圍內(nèi)，操作半衰期為25 d，該結(jié)果為殼聚糖微球固定化木瓜蛋白酶酶反應(yīng)器的試制和研究提供了重要的參考。2005年，劉琳琳等以磁性金屬鰲合瓊脂糖微球?yàn)檩d體，利用金屬鰲合配體（IDA-Cu2+）與蛋白質(zhì)表面供電子氨基酸相互作用的原理，定向固定了木瓜蛋白酶。固定化最適條件為Cu2+1.5×10-2mol/g載體、固定化時(shí)間為4 h、固定化pH7.0、給酶量30 mg/g載體。固定化酶的最適反應(yīng)溫度70℃、最適反應(yīng)pH8.0，固定化酶的熱穩(wěn)定性明顯高于溶液酶，固定化酶活力回收為68.4%，具有較好的操作穩(wěn)定性，載體重復(fù)使用5次后固定化酶酶活力為首次固定化酶的79.71%。2008年，何平等以乙腈作為有機(jī)介質(zhì)，在微水有機(jī)溶劑體系中以Boc-Trp-OH和Phe-NH2為底物，用海藻酸鈉、殼聚糖固定化木瓜蛋白酶催化合成Trp-Phe-NH2時(shí)，產(chǎn)率為27.8%，在這一合成反應(yīng)中，對(duì)pH值、離子強(qiáng)度、溶液含量、反應(yīng)溫度、酶用量和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)，證明pH是本合成過(guò)程的最重要影響因素。反應(yīng)體系以乙腈為有機(jī)介質(zhì)，在微水有機(jī)溶劑體系中以Boc-Tyr-Pro-OMe和Trp－Phe-NH2為底物，用IPSAC催化合成Tyr-Pro－Trp-Phe-NH2，產(chǎn)率為35.2%。2008年，王紅玉等以糖和脂質(zhì)體作為溶膠-凝膠法固定木瓜蛋白酶（Papain） 過(guò)程中的保護(hù)劑，研究了蔗糖、葡萄糖、海藻糖、木糖、麥芽糖及構(gòu)成脂質(zhì)體的正癸烷溶液中膽固醇含量、卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比等因素對(duì)固定化酶活性的影響。結(jié)果表明，80 μL20 mg/mLPapain溶液與15 mg木糖、500 μL正癸烷溶液（溶有體積分?jǐn)?shù)1.5%的膽固醇，卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比為4.5∶1）充分混合后制備的固定化酶活性最高，在優(yōu)化條件下制備的固定化酶包封率為42.0%，活力回收率為61.2%；SEM分析表明，固定化酶形態(tài)呈球狀且大小均勻，內(nèi)孔分布呈蜂窩狀；破膜劑對(duì)固定化酶活性發(fā)揮的影響研究表明，TritonX-100的效果最好。固定化酶包埋法是近十余年發(fā)展起來(lái)的酶應(yīng)用技術(shù)，在工業(yè)生產(chǎn)、化學(xué)分析和醫(yī)藥等方面有著誘人的應(yīng)用前景。

3.3 交聯(lián)法的應(yīng)用

交聯(lián)法是依靠雙功能團(tuán)試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)凝集成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使之不溶于水從而形成固定化酶。常采用的雙功能團(tuán)試劑有戊二醛、順丁烯二酸酐等。酶蛋白的游離氨基、酚基、咪唑基及巰基均可參與交聯(lián)反應(yīng)。2004年，黃宜兵等以變性的卵清蛋白為載體，用戊二醛為交聯(lián)劑固定木瓜蛋白酶，通過(guò)正交試驗(yàn)考察了固定化pH值、交聯(lián)劑戊二醛濃度、交聯(lián)時(shí)間和酶用量對(duì)固定化木瓜蛋白酶活力的影響，確定了最適固定化條件：戊二醛體積分?jǐn)?shù)為5%，pH 6.0、交聯(lián)時(shí)間20 h，每克載體含酶量12 mg。對(duì)比研究了游離木瓜蛋白酶和固定化木瓜蛋白酶的性質(zhì)，所得到的固定化木瓜蛋白酶最適溫度90℃，最適pH 9.0，米氏常數(shù)53.6 mg/mL，其熱穩(wěn)定性及耐熱性均較游離酶顯著提高。2001年，王海英等從8種載體材料中選取自制的氨基含量約2.878 mmol/g的甲殼質(zhì)作為固定化載體，采用吸附交聯(lián)法，以戊二醛為交聯(lián)劑，對(duì)木瓜蛋白酶進(jìn)行固定化。17.5 mg/g的固定化酶/載體比例、pH6、5℃條件下，先吸附10 min，再以體積分?jǐn)?shù)0.7%的戊二醛交聯(lián)12 h，所得固定化酶酶活回收可達(dá)52.0%，酶活力為3.54 U/g。固定化酶在65℃以下穩(wěn)定，溶液酶在55℃以下穩(wěn)定；固定化酶在pH 7.0以下穩(wěn)定，溶液酶在pH 6.0以下穩(wěn)定。5℃條件下，固定化酶貯藏半衰期為183 d，以酪蛋白為底物，固定化酶的操作半衰期可達(dá)27 d。用固定化酶水解甲殼胺，產(chǎn)物分子量小于100 000的甲殼胺低聚糖得率約為45.55%。2005年，肖寧等以介孔分子篩MCM-41作為載體，戊二醛作為交聯(lián)劑，對(duì)木瓜蛋白酶進(jìn)行了固定化，研究了固定化條件對(duì)酶活性及酶活性回收率的影響，并對(duì)固定化酶的連續(xù)操作穩(wěn)定性做了初步探討。結(jié)果表明：當(dāng)1 g載體的給酶量為20 mg、固定化溫度10℃～20℃、固定化時(shí)間2 h、pH 7.0、戊二醛體積分?jǐn)?shù)0.75%時(shí)，木瓜蛋白酶的固定化效果最好，此時(shí)酶活性平均回收率達(dá)55%左右，固定化酶具有良好的連續(xù)操作穩(wěn)定性，半衰期可達(dá)26 d。2007年，黃澤元采用殼聚糖與羧甲基纖維素鈉形成膠囊將木瓜蛋白酶固定化，研究了固定化木瓜蛋白酶的固定化條件。結(jié)果表明：在給酶量為50 mg/100mL、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%、pH7.5、固定化溫度50℃條件下，所得固定化木瓜蛋白酶活力回收率可達(dá)69.8%。

4 結(jié)論

綜上所述，固定化酶既保持了酶的催化性質(zhì)，又克服了游離酶的不足之處，具有如下顯著的優(yōu)點(diǎn)。

a.酶的穩(wěn)定性增加，減少溫度、pH、有機(jī)溶劑和其他外界因素對(duì)酶活力的影響，可以較長(zhǎng)期地保持較高的酶活力。

b.固定化酶可反復(fù)利用或連續(xù)使用較長(zhǎng)的時(shí)間，提高酶的利用價(jià)值，降低生產(chǎn)成本

c.固定化酶易于和反應(yīng)產(chǎn)物分開，有利于產(chǎn)物的分離純化，從而提高產(chǎn)品質(zhì)量。

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Research progresses on immobilization of papain

LIUJia-jun1，2*LI Bian-sheng1
1（College of Light Industryand Food Engineering，South China Universityof Technology，Guangzhou 510641，China）
2（Department ofFood and Bioengineering，GuangdongIndustryTechnical College，Guangzhou 510300，China）

Papain has a strongabilityofhydrolyzingproteins，but a poor stability，and is difficult torecycle.This paper discussed the immobilization technology of papain in recent years.A fixed papain，with a broad development prospects，not only maintain the enzyme's catalytic properties， but also overcome the shortcomings of the free enzyme.

papain； immobilization；application

TS261.1

A

1673-6004（2011）02-0008-03

*劉嘉俊，男，1982年出生，華南理工大學(xué)在職碩士研究生，食品工程專業(yè)，講師。

2011-04-06