黃世華 陳嘉勇 曾德妙

重組人生長激素(rhGH)對消化道惡性腫瘤患者術(shù)后進(jìn)行代謝調(diào)理治療，明顯促進(jìn)了腫瘤患者的康復(fù)，已經(jīng)在外科領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。但人生長激素(hGH)作為一種生長因子，腫瘤患者術(shù)后能否使用rhGH存在爭議。本研究從細(xì)胞周期角度探討rhGH對人胃、結(jié)腸癌細(xì)胞株MKN45和Colo320增殖的影響，為臨床胃、結(jié)腸癌術(shù)后患者能否應(yīng)用rhGH提供一定的實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 人胃癌細(xì)胞株MKN45、人結(jié)腸癌細(xì)胞株Colo320(中科院上海細(xì)胞生物所細(xì)胞庫);重組人生長激素(SAIZEN，瑞士Sernono公司);奧沙利鉑(L-OHP，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司);RPMI1640(美國GIBCO公司)。小牛血清(浙江省杭州四季青生物工程材料有限公司);流式細(xì)胞儀(美國COULTER公司，EPICXU型)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 對照組(RPMI1640)、抗腫瘤藥物組(LOHP)、rhGH組及L-OHP+rhGH組，后兩組又分為4個(gè)亞組，表1。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及樣品制備 MKN45、Colo320細(xì)胞在含10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液中、37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，4 g/L臺盼藍(lán)染色后計(jì)算細(xì)胞活率(Via=99%)，并細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1×105/ml備用。將細(xì)胞懸液接種于6孔板中，2 ml/孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，4 h細(xì)胞完全貼壁后加入藥物。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，PBS液洗滌，70%乙醇固定，4℃保存24 h。加入熒光素(碘化丙啶)染色，激發(fā)波長488nm進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及藥物濃度

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞周期 L-OHP組和L-OHP+rhGH組細(xì)胞周期發(fā)生明顯變化。G0～G1期:L-OHP組和L-OHP+rhGH組比對照組或rhGH組顯著增加，且L-OHP+rhGH與對應(yīng)的rhGH組配對比較也顯著增加(P＜0.01)，其他各組間沒有顯著差異(P＞0.05)。S期:L-OHP組和L-OHP+rhGH組比對照組和rhGH組降低(P＜0.01)，且L-OHP+rhGH與對應(yīng)的rhGH組比較S期細(xì)胞減少(P＜0.01);同時(shí)，L-OHP+rhGH組間隨著rhGH劑量的增加沒有明顯的變化規(guī)律。rhGH組和對照組比較雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但有升高趨勢。G2～M期:LOHP組和L-OHP+rhGH組比對照組和rhGH組降低(P＜0.05)，rhGH組與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);同時(shí)，L-OHP+rhGH組與對應(yīng)的rhGH組及對照組比較，G2～M 期細(xì)胞也減少(P＜0.05)，但胃癌細(xì)胞無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 藥物作用后MKN45和Colo320細(xì)胞株各組的增殖周期百分?jǐn)?shù)(±s)

表2 藥物作用后MKN45和Colo320細(xì)胞株各組的增殖周期百分?jǐn)?shù)(±s)

注:與對照組和rhGH各亞組比較，*P＜0.01

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2.2 細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)

L-OHP組和L-OHP+rhGH組的PI較對照組明顯降低(P＜0.01)，L-OHP+rhGH組與對應(yīng)的rhGH組配對比較其PI顯著降低(P＜0.01);同時(shí)，rhGH組與對照組、L-OHP+rhGH組與L-OHP組比較PI均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。

表3 藥物作用后MKN45和Colo320細(xì)胞株各組細(xì)胞增殖指數(shù)(x±s)

3 討論

hGH用于腫瘤患者術(shù)后代謝調(diào)理至今存在爭論，因?yàn)橛胁簧賹W(xué)者認(rèn)為hGH存在潛在影響腫瘤生長的促有絲分裂效應(yīng)。本研究結(jié)果提示用hGH單獨(dú)處理兩株細(xì)胞，細(xì)胞周期、PI及DNA抑制率均未發(fā)生明顯改變。此結(jié)果與Harrison等人發(fā)現(xiàn)給皮下接種了胰腺癌細(xì)胞的Athymic小鼠體內(nèi)注射hGH的實(shí)驗(yàn)相符，15 d后檢測發(fā)現(xiàn)，hGH體內(nèi)應(yīng)用僅提高了血漿IGF-1水平和肝內(nèi)蛋白合成速率，沒有促進(jìn)腫瘤生長，也未改變細(xì)胞周期動力學(xué)和腫瘤組織的蛋白合成速率［1］。

大量文獻(xiàn)報(bào)道，hGH能調(diào)節(jié)免疫功能，改善患者細(xì)胞和體液性的全身宿主防御，尤其是雙向調(diào)控NK細(xì)胞，促進(jìn)創(chuàng)傷患者的正氮平衡、加速傷口愈合、減少并發(fā)癥有重要意義。有學(xué)者經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，hGH和IGF-1能增強(qiáng)TPN應(yīng)用過程中的免疫反應(yīng)，促進(jìn)TPN的蛋白合成作用，改善瘦體組織群，提高宿主的免疫功能，減少感染風(fēng)險(xiǎn)，但并不促進(jìn)腫瘤生長。有文獻(xiàn)報(bào)道rhGH用于術(shù)后惡性腫瘤患者的代謝調(diào)理［2，3］，對促進(jìn)患者正氮平衡起到了積極的作用。有的學(xué)者認(rèn)為rhGH不會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖分裂，吳力群等［4］研究表明hGH對大鼠移植性肝腫瘤的生長無促進(jìn)作用，與生長抑素合用可抑制肝腫瘤的生長。Harrison等［1］報(bào)道在他們治療的一組消化道腫瘤患者術(shù)后應(yīng)用rhGH的隨訪病例中未發(fā)現(xiàn)其對腫瘤的復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用;Jurgen等［5］對75例胃腸道腫瘤患者術(shù)后短期應(yīng)用rhGH發(fā)現(xiàn)rhGH不會促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)。Fiebig等［6］在體外用7種不同的人腫瘤細(xì)胞(結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌和前列腺癌)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)rhGH不會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。

就體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析，MKN45和Colo320細(xì)胞都是惡性程度高的細(xì)胞株，本研究結(jié)果提示rhGH在體外總的趨勢是對人胃、結(jié)腸癌細(xì)胞增殖分裂無明顯促進(jìn)作用。rhGH組與對照組、L-OHP+rhGH組與L-OHP組比較在細(xì)胞周期中各期細(xì)胞數(shù)量和PI均無顯著差異(P＞0.05)，表明rhGH對體外培養(yǎng)的胃、結(jié)腸癌細(xì)胞無促進(jìn)增殖的作用。在rhGH與LOHP合用與對照組和rhGH組比較，S期及G2～M期的細(xì)胞及PI明顯減少(P＜0.01;胃癌細(xì)胞G2～M期P＞0.05)。為臨床胃腸道腫瘤患者術(shù)后應(yīng)用rhGH進(jìn)行代謝調(diào)理提供一定參考。由于本實(shí)驗(yàn)未對細(xì)胞進(jìn)行同步化處理，所以不能對胃、結(jié)腸癌細(xì)胞兩株細(xì)胞株進(jìn)行比較。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)提示rhGH在體外不促進(jìn)人胃、結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖分裂，與以往文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似［7-9］。

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