許愛平 路箏 高軍 李淑德 李兆申

·論著·

髓樣細(xì)胞表達(dá)的激發(fā)受體-1在急性壞死性胰腺炎小鼠中的表達(dá)

許愛平 路箏 高軍 李淑德 李兆申

目的檢測(cè)急性壞死性胰腺炎(ANP)小鼠外周血及胰腺組織中髓樣細(xì)胞表達(dá)的激發(fā)受體-1(TREM-1)的表達(dá)，探討其在ANP發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法50只雄性昆明小鼠按隨機(jī)表法分為對(duì)照組，ANP 24、48、72、96 h組。以腹腔注射20%L-精氨酸4 mg/g體重、間隔1 h重復(fù)一次的方法制備ANP模型。對(duì)照組腹腔注射等容積生理鹽水。取血檢測(cè)淀粉酶、肌酐和谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量；取胰腺組織行病理學(xué)檢查并評(píng)分；采用實(shí)時(shí)定量 PCR法檢測(cè)外周血白細(xì)胞TREM-1 mRNA的表達(dá)；免疫組化法檢測(cè)胰腺組織TREM-1蛋白表達(dá)。結(jié)果ANP 24 h組小鼠血清淀粉酶、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平為(9439±1273)U/L、(84.8±75.9)μmol/L、(158.1±122.1)U/L，均較對(duì)照組的(2412±297)U/L、(29.2±19.1)μmol/L、(41.4±7.9)U/L顯著升高。ANP組胰腺組織的病理評(píng)分隨著時(shí)間推移而增加。ANP 24、48、72、96 h組的TREM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為15.55、30.36、15.77、28.32， ANP 48 h組的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)組(P值均<0.01)，而胰腺組織TREM-1蛋白表達(dá)隨胰腺炎的病程進(jìn)展無顯著變化。結(jié)論TREM-1可能還通過促發(fā)其他炎癥因子參與ANP的進(jìn)展過程。

胰腺炎，急性壞死性； 髓樣細(xì)胞表達(dá)的激發(fā)受體-1； 炎癥趨化因子類

髓樣細(xì)胞表達(dá)的激發(fā)受體-1(triggering receptor expressed on myeloid cells, TREM-1)屬于免疫球蛋白超家族，它可能是觸發(fā)并擴(kuò)大炎癥反應(yīng)、介導(dǎo)膿毒性休克的關(guān)鍵介質(zhì)[1]。大量研究結(jié)果證實(shí)，TREM-1在膿毒癥、肺部感染、炎癥性腸病、細(xì)菌性腦膜炎等炎癥性疾病的鑒別、診斷和預(yù)后判斷中有重要價(jià)值。Wang等[2]報(bào)道，TREM-1 mRNA在輕、重型急性胰腺炎患者的白細(xì)胞中表達(dá)增加。本實(shí)驗(yàn)觀察急性壞死性胰腺炎(ANP)小鼠外周血及胰腺組織中TREM-1 mRNA及蛋白的表達(dá)，探討TREM-1在胰腺炎發(fā)生、發(fā)展中的作用及可能機(jī)制。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性昆明小鼠50只，清潔級(jí)，體重20～22 g，由第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供。按隨機(jī)表法分成對(duì)照組，ANP 24、48、72、96 h組，每組10只。采用腹腔注射20% L-精氨酸4 mg/g體重、間隔1 h重復(fù)注射一次的方法制備ANP模型。對(duì)照組腹腔注射等容積生理鹽水。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)分批處死小鼠，心臟取血，留取血清和胰腺組織標(biāo)本。

二、檢測(cè)項(xiàng)目及方法

1．血清淀粉酶、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)：應(yīng)用HITACHI-7150型自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

2．胰腺病理學(xué)檢查：部分胰腺組織常規(guī)行病理學(xué)檢查，并參考Rongione標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。

3．外周血TREM-1 mRNA檢測(cè)：外周血分離、棄血清、裂解紅細(xì)胞后，應(yīng)用Trizol抽提白細(xì)胞總RNA，置-80℃?zhèn)溆?。根?jù)Genbank中的基因序列自行設(shè)計(jì)引物，上游5′-CTGTGCGTGTTCTTTGTC-3′，下游5′-GGTTCCTTCCCGTCTG-3′，產(chǎn)物133 bp；內(nèi)參GAPDH上游5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′，產(chǎn)物233 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Premix Ex TagTM(Takara公司)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)條件:95℃ 10 s,95℃ 5 s,60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果以Ct值顯示，△Ct值= Ct值目的基因-Ct值內(nèi)參基因；△△Ct值=△Ct值目的基因-△Ct值內(nèi)參基因；以對(duì)照組表達(dá)量為1，2-△△Ct值即為目的段基因較對(duì)照組mRNA表達(dá)的倍數(shù)。

4．胰腺組織TREM-1蛋白檢測(cè)：采用Envison兩步法檢測(cè)。大鼠抗小鼠TREM-1 Antibody購(gòu)自R&D公司，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。TREM-1定位于胞膜、胞質(zhì)，陽(yáng)性染色為棕黃色或棕褐色。光鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算染色細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)，≥20%為陽(yáng)性，<20%為陰性。染色強(qiáng)度：淡黃色為+，黃色++，棕黃色+++，褐色++++。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、血清淀粉酶、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶的變化

ANP組小鼠血清淀粉酶、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平均較對(duì)照組顯著升高。淀粉酶、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶在制模后24 h均達(dá)峰值，此后逐漸降低(表1)。

表1 各組血清淀粉酶、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶的變化

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05

二、胰腺病理變化

對(duì)照組小鼠胰腺無明顯變化。ANP 24 h組小鼠肉眼可見腹腔微量腹水;48 h組腹腔有大量血性積液,并見胰腺水腫、壞死;72 h和96 h組病變更為嚴(yán)重。鏡下見24 h組胰腺小葉間隙略增寬、水腫、充血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)；48 h組胰腺小葉結(jié)構(gòu)紊亂,小葉間水腫、充血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)加重；72 h組胰腺大片壞死，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加；96 h組炎細(xì)胞大量浸潤(rùn),彌漫性腺泡細(xì)胞壞死,壞死區(qū)周圍炎細(xì)胞浸潤(rùn),部分腺泡呈孤島狀,核固縮、脂肪組織壞死(圖1)。

ANP各組病理評(píng)分見表2。胰腺組織炎癥反應(yīng)、水腫程度和壞死隨著病程進(jìn)展程度加重(P<0.05)，出血病變?cè)?8、72和96 h組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.773)。

三、外周血TREM-1 mRNA表達(dá)的變化

ANP 24、48、72、96 h組的TREM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為15.55、30.36、15.77、28.32， ANP 48 h組的TREM-1 mRNA表達(dá)量顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)組 (P值均< 0.01)。

圖1ANP 24 h組(a)、48 h組(b)、72 h組(c)、96 h組(d)胰腺組織病理改變(HE ×100)

表2 ANP各組胰腺組織病理評(píng)分

注：與ANP 24 h組比較，aP<0.05,bP<0.01

四、胰腺組織中TREM-1蛋白表達(dá)的變化

對(duì)照組胰腺無TREM-1蛋白表達(dá)。ANP組有TREM-1的表達(dá)(圖2)，24 h時(shí)11例TREM-1表達(dá)陽(yáng)性，其中+++以上5例；48 h時(shí)11例陽(yáng)性，+++以上6例；72 h時(shí)11例陽(yáng)性， +++以上6例。TREM-1蛋白表達(dá)隨胰腺炎的病程進(jìn)展無顯著變化。

討 論

Bouchon等[3]應(yīng)用特異性抗TREM-1單克隆抗體證實(shí)了血液中的中性粒細(xì)胞和CD14單核/巨噬細(xì)胞表達(dá)TREM-1。Colonna等[4]報(bào)道，正常肺組織的巨噬細(xì)胞也表達(dá)TREM-1。機(jī)體感染時(shí)，浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞及被感染的皮膚和淋巴結(jié)中的上皮細(xì)胞均能高表達(dá)TREM-1。TREM-1可促進(jìn)炎性因子分泌，引起炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)、放大，導(dǎo)致過度的炎癥反應(yīng)[5]。此外，TREM-1在天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答方面都起著重要作用。

圖2 ANP組胰腺組織中TREM-1的表達(dá)(SP ×400)

Wang等[2]檢測(cè)輕、重型急性胰腺炎患者及正常人白細(xì)胞中TREM-1 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常人相比較，急性胰腺炎(AP)患者白細(xì)胞中TREM-1的表達(dá)量明顯上調(diào)，且與患者病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，推測(cè)TREM-1在AP尤其是SAP的發(fā)生、發(fā)展中可能起著至關(guān)重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ANP小鼠外周血中TREM-1 mRNA 的水平隨著病程的進(jìn)展逐漸升高，48 h達(dá)到頂峰，后逐漸下降，表明TREM-1的表達(dá)并非隨著病程的進(jìn)展呈線型增高。此外，胰腺組織中TREM-1蛋白表達(dá)隨ANP的病程進(jìn)展亦無顯著變化。因此，初步推測(cè)TREM-1作為炎癥介質(zhì)在炎癥反應(yīng)過程中可能還通過促發(fā)其他炎癥因子參與整個(gè)疾病進(jìn)程。

[1] Bouchon A,Facchetti F,Weigand MA,et al.TREM-1 amplifies inflammation and is a crucial mediator of septic shock. Nature,2001,410:1103-1107.

[2] Wang DY,Qin RY,Liu ZR,et al.Expression of TREM-1 mRNA in acute pancreatitis.World J Gastroenterol,2004,10:2744-2746.

[3] Bouchon A,Dietrich J,Colonna M.Cutting edge:inflammatory responses can be triggered by TREM-1,a novel receptor expressed on neutrophils and monocytes.J Immunol,2000,164:4991-4995.

[4] Colonna M,Facchetti F.TREM-1 (triggering receptor expressed on myeloid cells):a new player in acute inflammatory responses.J Infect Dis,2003,187:S397-S401.

[5] Radsak MP,Salih HR,Rammensee HG,et al.Triggering receptor expressed on myeloid cells-1 in neutrophil inflammatory responses: differential regulation of activation and survival.J Immunol,2004,172:4956-4963.

2009-11-13)

(本文編輯：呂芳萍)

ExpressionofTREM-1inmicewithacutenecrotizingpancreatitis

XUAi-ping,LUZheng,GAOJun,LIShu-de,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-Shen,Email;zhsli@81890.net

ObjectiveTo detect the expression of triggering receptor expressed on myeloid cells-1(TREM-1) in mice with acute necrotizing pancreatitis (ANP).MethodsMale kunming mice (n=50) were randomly divided to control group, ANP 24, 48, 72, 96 h group. ANP model was induced by intraperitoneally injection with 20% L-arginine at a dose of 4 mg/g each, 1 h apart. Mice in control group

intraperitoneally injections of same amount of normal saline. Serum amylase, creatinine, and ALT were examined and pathological evaluation of pancreatic tissues was performed. The expression of TREM-1 mRNA in peripheral blood leucocyte was determined by RT-PCR. The expression of TREM-1 protein in pancreatic tissue was detected by immunohistochemistry.ResultsSerum amylase, creatinine, and ALT in ANP 24 h were (9439±1273)U/L, (84.8±75.9)μmol/L, (158.1±122.1)U/L, which were significantly higher than those in control group [(2412±297)U/L,(29.2±19.1)μmol/L, (41.4±7.9)U/L)]. The pathological scores of the pancreas in ANP group increased corresponding to time. The expressions of TREM-1 mRNA in ANP 24, 48, 72, 96 h group were 15.55, 30.36, 15.77, 28.32, and the expressions of TREM-1 mRNA in ANP 48 h group was significantly higher than that in other groups (P<0.01). The expressions of TREM-1 protein in the pancreas did not significantly change corresponding to time.ConclusionsTREM-1 may be involved in the development of ANP by triggering other inflammatory factors.

Pancreatitis，acute necrotizing； Triggering receptor expressed on myeloid cells-1； Chemokines

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.014

2008年度國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30772138)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化科

李兆申，Email：zhsli@81890.net