高振軍 孔慶云 吳愷 王興鵬

·論著·

AMD3100對胰腺癌細胞AsPC-1及其移植瘤血管生成的影響

高振軍 孔慶云 吳愷 王興鵬

目的探討非肽類特異性CXCR4拮抗劑AMD3100對胰腺癌細胞株AsPC-1細胞增殖及其移植瘤生長的影響。方法AsPC-1細胞分為對照組、基質細胞衍生因子-1(SDF-1α)處理組、AMD3100處理組和SDF-1α+AMD3100處理組，MTT法檢測細胞增殖，Western blotting檢測血管內皮生長因子(VEGF)表達。建立AsPC-1細胞裸鼠移植瘤模型，應用AMD3100瘤內及瘤周注射，觀察移植瘤的生長，免疫組化法檢測裸鼠移植瘤的微血管密度(microvessel density, MVD)。結果SDF-1α可明顯促進AsPC-1細胞增殖(1.430±0.122對1.002±0.001，P<0.05)，而同時應用AMD3100處理能抑制這種增殖反應(0.983±0.068 對 1.430±0.122，P<0.05)；SDF-1α亦可促進AsPC-1細胞VEGF的表達(0.565±0.047 對 0.439±0.034，P<0.05)，而同時用AMD3100處理可抑制這種效應(0.450±0.071 對 0.565±0.047，P<0.05)。AMD3100可抑制AsPC-1細胞皮下移植瘤的生長，第24天的抑瘤率達59.5%，移植瘤的MVD顯著減少(28.56±6.94 對 98.75±20.60，P<0.01)。結論AMD3100在體外和體內均可抑制AsPC-1細胞增殖及其移植瘤的血管生成。

胰腺腫瘤； AMD3100； 細胞增殖； 血管生成

胰腺癌是一種具有高侵襲傾向的惡性腫瘤，80%以上的病例會發(fā)生局部蔓延和淋巴結轉移[1]?；|細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)是一類在腫瘤侵襲轉移中受到越來越多關注的趨化因子，與其受體結合可促進腫瘤的生長、增殖、侵襲、轉移及血管生成[2-3]。AMD3100是一種小分子非肽類特異性CXCR4拮抗劑，屬于雙螯環(huán)類(Bicyclam)化合物，可與CXCR4第二胞外環(huán)的門冬氨酸殘基結合，抑制SDF-1與CXCR4結合，以及由此引發(fā)的下游信號轉導反應。本研究旨在觀察SDF-1α及AMD3100對胰腺癌細胞株AsPC-1細胞增殖及其移植瘤血管生成的影響。

材料與方法

一、細胞培養(yǎng)

人胰腺癌細胞系AsPC-1購自中科院細胞庫，常規(guī)培養(yǎng)傳代。

二、細胞增殖實驗

采用MTT法。取對數生長期細胞，制成單細胞懸液，按5×103個/孔接種于96孔板，貼壁生長后換無血清培養(yǎng)基，分成4組，分別加AMD3100(Sigma-Aldrich公司) 100 ng/ml、SDF-1α(Peprotech公司)100 ng/ml及SDF-1α+AMD3100和只加無血清培養(yǎng)基的對照組，每組設5個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加5 mg/ml的MTT(Sigma-Aldrich公司)20 μl，培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加150 μl DMSO，振蕩10 min，用酶標儀測定A490值。

三、細胞VEGF蛋白表達檢測

采用Western blotting法。提取上述各組培養(yǎng)24 h細胞的總蛋白，常規(guī)行Western blotting。抗VEGF一抗1∶500稀釋、二抗1∶500稀釋，最后ECL發(fā)光。以β-actin為內參照。圖像掃描儀掃描條帶灰度值，以VEGF條帶與β-actin條帶灰度值比表示VEGF相對表達量。

四、動物及體內成瘤實驗

Balb/c裸鼠，雌性，5～6周齡，體重20 g左右，購自中國科學院上海實驗動物中心(合格證書No.159)。實驗前在SPF級環(huán)境適應性飼養(yǎng)1周。無菌條件下給每只裸鼠背部皮下接種AsPC-1細胞2×106個，以皮下結節(jié)直徑>0.5 mm3為成瘤標準。1周后將10只成瘤裸鼠數字表法隨機分為AMD組和對照組。AMD組在瘤體長徑達0.5 cm時注射AMD3100 7.5 mg/kg體重，一半劑量注入瘤體中央，另一半注射在瘤周，1次/3 d。對照組注射等容積生理鹽水。每3 d測量腫瘤長、短徑，并計算腫瘤體積：V=ab2/2(a為腫瘤長徑，b為腫瘤短徑)，繪制腫瘤生長曲線。治療后24 d處死動物，剝取瘤體稱瘤量。抑瘤率(inhibitory rate, IR)=(1 -治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%。并將瘤體迅速放入10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。

五、移植瘤微血管密度(MVD)檢測

采用免疫組化SABC染色法，嚴格按免疫組化染色試劑盒(武漢博士德公司)說明操作。以PBS代替一抗作陰性對照。采用雙盲法閱片。結果判斷：以胞質出現棕黃色著色為血管內皮細胞陽性，在腫瘤區(qū)內單個或成叢的內皮細胞均視為單個血管，只要結構不連接，其分支也作為血管，凡管徑>8個紅細胞或帶有肌層的血管不計數。每張切片隨機觀察10個高倍鏡視野(10×40)，計數MVD。

六、統(tǒng)計學處理

結 果

一、AMD3100對AsPC-1細胞增殖的影響

對照組AsPC-1細胞增殖的A490值為1.002±0.001。AMD3100處理組細胞增殖的A490值為1.005±0.110，與對照組無明顯差異(P>0.05)。SDF-1α處理組細胞增殖的A490值為1.430±0.122，顯著高于對照組(P<0.05)，而同時用AMD3100處理，則能抑制細胞增殖反應(P<0.05)，A490值為0.983±0.068，與對照組無顯著差異(P>0.05)。

二、 AMD3100對AsPC-1細胞VEGF蛋白表達的影響

對照組、SDF-1α組、AMD3100組和SDF-1α+AMD3100組細胞的VEGF表達量分別為0.439±0.034、0.565±0.047、0.426±0.059和0.450±0.071(圖1)。SDF-1α可促進AsPC-1細胞VEGF的表達(P<0.05)，而同時應用AMD3100可抑制這種促進效應(P<0.05)。

三、 AMD3100對AsPC-1細胞裸鼠皮下移植瘤生長的抑制作用

各組裸鼠生長、飲食、活動情況良好，無死亡。移植瘤外觀呈大的球形瘤結節(jié)或數個小的瘤結節(jié)簇生(圖2)。AMD3100組移植瘤生長速度明顯小于對照組(P<0.05，圖3)，24 d的IR為59.5%。

圖1 AMD3100對AsPC-1細胞VEGF蛋白表達的影響

圖2 對照組(a)、AMD3100組(b)移植瘤離體圖

圖3 裸鼠移植瘤生長曲線

四、裸鼠皮下移植瘤MVD變化

AMD3100瘤內注射24 d后，移植瘤的MVD為28.56±6.94，明顯低于對照組的 98.75±20.60(P<0.01，圖4)。

圖4AMD3100組(a)和對照組(b)裸鼠皮下移植瘤MVD(IHC ×200)

討 論

越來越多的證據表明，在腫瘤微環(huán)境中具有復雜的趨化因子/受體網絡，與腫瘤的生物學行為有關[4]，CXCR4在許多惡性腫瘤組織中表達水平明顯升高，SDF-1和CXCR4結合激活特異性信號轉導通路，引起原位和轉移瘤的生長。AMD3100可抑制SDF-1與CXCR4的結合，阻斷隨后的一系列生理過程[5]。

Marchesi等[6]發(fā)現，SDF-1α可促進胰腺癌細胞增殖。本實驗結果顯示，SDF-1α可促進AsPC-1細胞增殖，但這種作用可被AMD3100抑制。體內實驗亦顯示，在AsPC-1細胞皮下移植瘤體及瘤周注射AMD3100可明顯抑制移植瘤的生長，24 d時的抑瘤率接近60%，提示AMD3100在體內外均可顯著抑制CXCR4陽性胰腺癌細胞的增長。

癌細胞在體內生長及侵襲轉移中需有新生血管的存在，VEGF是一種有效的促血管生成因子，它與MVD增加、腫瘤局部侵襲和轉移及術后復發(fā)有關[7]。新近的一項研究認為，VEGF是一種CXCR4下游的靶基因[8]。本實驗結果顯示，SDF-1α可促進AsPC-1細胞VEGF的表達，而AMD3100可抑制這種促進作用，體內實驗亦顯示AMD3100可抑制移植瘤的血管生成。

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2009-10-12)

(本文編輯：屠振興)

EffectofAMD3100ontheproliferationandangiogenesisofAsPC-1cells

GAOZhen-jun,KONGQing-yun,WUKai,WANGXing-peng.

DepartmentofGastroenterology,LianyungangFirstHospital,XuzhouMedicalCollege,Lianyungang222002,China

WANGXing-peng,Email:xpwcn@public7.sta.net.cn

ObjectiveTo investigate the effects of blockade on non-peptide specific SDF-1/CXCR4 receptor ligand system with AMD3100 on the proliferation and angiogenesis of human pancreatic cancer cells AsPC-1.MethodsAsPC-1 was divided into control group, SDF-1α group, group, SDF-1α+ AMD3100 group. MTT test was performed to determine the proliferative level of AsPC-1 cells. Vascular endothelial growth factor (VEGF) was detected with Western blotting assay. Immunohistochemistry was used to detect the microvessel density (MVD) in subcutaneous xenografts of AsPC 1 of nude mice model, which was intratumorally and peritumorally injected with AMD3100.ResultsSDF-1α could induce the proliferation of AsPC-1(1.430±0.122vs1.002± 0.001,P<0.05). While the proliferative effect induced by SDF-1α could be inhibited by AMD3100 (0.983±0.068vs1.430 ± 0.122,P<0.05). SDF-1α could induce the expression of VEGF (0.565 ±0.047vs0.439 ± 0.034,P<0.05). While the protein expression of VEGF induced by SDF-1α on AsPC-1 cells was inhibited by AMD3100 (0.450 ± 0.071vs0.565±0.04,P<0.05). The growth and angiogenesis of subcutaneous xenografts of nude mice model were inhibited by AMD3100; the tumor inhibitory rate was 59.5% at 24th day. The MVD of xenografts was significantly decreased (28.56±6.94vs98.75±20.60,P<0.01).ConclusionsAMD3100 could inhibit the proliferation and angiogenesis of AsPC-1 cells both in vitro and in vivo.

Pancreatic neoplasms; AMD3100; Cell proliferation; Angiogenesis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.010

222002 連云港，徐州醫(yī)學院附屬連云港醫(yī)院消化科(高振軍、孔慶云)；上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院消化科(吳愷)；同濟大學附屬第十人民醫(yī)院消化科(王興鵬)

王興鵬，Email: xpwcn@public7.sta. net. cn