吳小曼,徐 滟,石蓓佳

(1.江蘇省食品藥品檢驗所,江蘇 南京 210008;2.南京中醫(yī)藥大學,江蘇 南京 210046)

復方甘草酸苷片是由甘草酸苷、甘氨酸和蛋氨酸組成的復方制劑,為一安全、有效的保肝護肝制劑,具有保護肝細胞膜、抗炎、免疫調節(jié)等作用。本品按進口藥品復核標準[1]檢驗,其中苷氨酸采用薄層掃描法測定,蛋氨酸采用回滴定法測定,操作步驟較為繁瑣。有文獻報道采用2,4-二硝基氟苯衍生化[2-3]或氯甲酸 9-芴基甲酯衍生化[4-5]HPLC法同時測定兩者含量,但衍生化法影響因素較多。采用HPLC法直接測定本品中兩種氨基酸含量的方法尚未見報道,本文參照有關文獻[6]建立了HPLC法直接測定復方甘草酸苷片中甘氨酸和蛋氨酸的含量。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀(包括二元輸液泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器)。

甘氨酸對照品(批號:140689-200401)、蛋氨酸對照品(批號:140684-200401),中國藥品生物制品檢定所;復方甘草酸苷片,江蘇某藥業(yè)有限公司,批號 :08086A、08086B、08086C;乙腈為色譜醇;水為純化水;其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Agilent HC-C18(2)色譜柱(4.6 mm×250 mm,5μm);以乙腈 -0.05 moL/L磷酸二氫鉀溶液(50%磷酸調節(jié) p H值至2.5)(5∶95)為流動相;流速:0.8mL/min;檢測波長:200 nm;柱溫:30℃,進樣量:10μL。

2.2 溶液的制備

對照品溶液:精密稱取甘氨酸與蛋氨酸對照品適量,加水溶解并稀釋制成每1mL約含甘氨酸與蛋氨酸各 0.5mg的溶液,搖勻,即得。

供試品溶液:取本品 20片,精密稱定,研細,精密稱取適量(約相當于甘氨酸和蛋氨酸各 25mg),置50mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液。

2.3 專屬性試驗

對照品溶液和供試品溶液的色譜圖見圖1。另按處方比例配制不含甘氨酸與蛋氨酸的陰性樣品,再按供試品溶液的制備方法制備得陰性對照溶液,進樣,記錄色譜圖(圖1);另取本品細粉適量(約相當于甘氨酸和蛋氨酸各 25mg),置50mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液進樣,利用DAD檢測器進行色譜峰純度檢查,記錄色譜圖,甘氨酸峰的純度因子為997.349,蛋氨酸峰的純度因子為997.788。結果均表明,處方中的輔料及甘草酸苷對測定無干擾。

圖1 對照品(A)、供試品的(B)及陰性對照(C)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance(A),sample(B)and blank sample(C)

2.4 線性關系

取甘氨酸與蛋氨酸對照品各約40mg,精密稱定,置20mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻。精密量取0.5,1.0,2.0,4.0,5.0mL,分別置10mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,精密量取10μL,分別注入色譜儀,記錄色譜圖,以峰面積(A)對濃度(C)作線性回歸,得回歸方程為:甘氨酸 A=667.21 C-6.072 9,r=1.000 0;蛋氨酸 A=9 255.1 C+122.9,r=0.999 9。

結果表明,在0.10～1.0mg/mL范圍內(nèi),甘氨酸與蛋氨酸溶液濃度均與峰面積呈良好線性關系。

2.5 回收率試驗

取已知含量的本品細粉適量(約相當于甘氨酸和蛋氨酸各 12.5mg),分別置9個 50mL量瓶中,再分別精密稱取甘氨酸與蛋氨酸對照品各 10,12.5和15mg,各 3份,置上述量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,取續(xù)濾液作為供試品溶液,測定,結果見表1。甘氨酸和蛋氨酸的平均回收率分別為100.29%和99.58%,RSD(n=9)分別為0.97%和0.75%。

2.6 溶液的穩(wěn)定性

取供試品溶液自配制后分別在0,2,4,6,8 h進樣,測定峰面積,甘氨酸與蛋氨酸的RSD分為0.54%與0.34%,表明該溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

表1 甘氨酸與蛋氨酸的加樣回收率試驗(n=9)Tab.1 Recovery rate of glycine and methionine(n=9)

取同一批樣品(080806A),同法配制 6份供試品溶液,分別測定含量。甘氨酸和蛋氨酸的平均含量分別為100.4%和100.0%,RSD分別為0.53%和0.76%。表明方法的重復性良好。

2.8 含量測定

本品 3批,分別按 2.2項下的方法制備對照品溶液及供試品溶液,按 2.1項下的色譜條件,進樣10μL,記錄色譜圖,按外標法分別以峰面積計算含量,同時與文獻方法[1]測定結果比較,見表2,甘氨酸的測定結果有較大差異,這可能與薄層掃描法精密度與準確度都不高有關,兩種方法蛋氨酸的測定結果基本一致。

表2 不同方法測定甘氨酸與蛋氨酸含量的比較Tab.2 Determination results of glycine and methionine by different methods

3 討 論

流動相的pH對分離度、峰形及保留時間有影響,pH為4.5時甘氨酸與相鄰峰分離不好,蛋氨酸峰變形;pH為3.5時甘氨酸與相鄰峰分離度好,但蛋氨酸峰分叉;pH為2.5時甘氨酸與蛋氨酸峰形均很好,理論板數(shù)均在10 000以上,甘氨酸與相鄰峰的分離度大于2.0。流動相的pH對甘氨酸的保留時間基本無影響,隨著 pH值減小,蛋氨酸的保留時間延長。

我們對檢測波長進行了選擇。甘氨酸和蛋氨酸均在200～220 nm波長范圍內(nèi)有吸收,屬末端吸收,且吸光度隨波長增大而減小;同時在200,203,205 nm進行檢測,基線噪音基本相同,甘氨酸響應值減少明顯,故選擇 200 nm作為測定波長。

分別采用水和流動相為溶劑,色譜行為基本相同,故選用前者。由于檢測波長為200 nm,對照品與供試品圖譜中,甘氨酸峰后有一小峰。分別配制甘氨酸與蛋氨酸的對照品溶液,相應圖譜中均有此峰;采用流動相配制,此峰亦存在;可能為水中少量的氯離子峰,向水中加入少量的鹽酸溶液,進樣,氯離子峰與上述小峰不完全對應;由于此小峰與甘氨酸分離度大于2.0,故不影響含量測定。另外,本品處方中還有甘草酸苷,由于本色譜系統(tǒng)中流動相洗脫能力較弱,甘草酸苷不出峰,故對本法無干擾。

本法與薄層掃描法、衍生化HPLC法比較,具有簡便、快速、結果準確的優(yōu)點。

[1]中國藥品生物制品檢定所.進口藥品復核標準匯編[S].2000:373-374.

[2]田莉,高曉黎,云琦.反相高效液相色譜法測定復方甘草甜素片三組分的含量[J].新疆醫(yī)科大學學報,2005,28(1):27-29.

[3]杜萍,孫明.HPLC法測定復方甘草酸苷膠囊中三組分的含量[J].中國藥師,2007,10(10):1004-1006.

[4]張衛(wèi)東.RP-HPLC法同時測定復方甘草酸苷片中三組分的含量[J].中國藥物應用與檢測,2009,6(3):153-155.

[5]靳穎華,張衛(wèi)東,齊平.柱前衍生化HPLC法同時測定復方甘草酸苷膠囊中甘氨酸和蛋氨酸的含量[J].解放軍藥學學報,2009,25(2):172-174.

[6]吳小曼,紀宇.反相高效液相色譜法測定復方氨基酸注射液中的乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸[J].中國生化藥物雜志,2003,24(4):194-195.